儀器分析教學(xué)課件之色譜分析概論

1、第十六章 色譜分析概論（Introduction to Chromatographic Analysis）第一節(jié) 色譜法概述 一、色譜法的由來 11906年由俄國(guó)植物學(xué)家 Tsweet 創(chuàng)立植物色素分離。next 2現(xiàn)在：一種重要的分離、分析技術(shù)分離混合物各組分并加以分析 固定相除了固體，還可以是液體。 流動(dòng)相液體或氣體。 色譜柱各種材質(zhì)和尺寸。 被分離組分不再僅局限于有色物質(zhì)。next固定相CaCO3顆粒流動(dòng)相石油醚 色帶back二、色譜法定義、實(shí)質(zhì)和目的定義：利用物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)建立的分離分析方法。實(shí)質(zhì)：分離。目的：定性分析或定量分析。三、分類：1按兩相分子的聚集狀態(tài)分類：流動(dòng)相 固定相

2、 類型液體 固體 液-固色譜液體 液體 液-液色譜液相色譜（LC）氣體 固體 氣-固色譜氣體 液體 氣-液色譜氣相色譜（GC）超臨界流體 超臨界流體色譜（SFC）2按固定相的固定方式分類： 平面色譜（Planar chromatography） 紙色譜 薄層色譜 高分子薄膜色譜 柱色譜（Column chromatography） 填充柱色譜 毛細(xì)管柱色譜 毛細(xì)管電泳法（Capillary electrophoresis）3按分離機(jī)制分類： 分配色譜：利用分配系數(shù)的不同。（Partition chromatography） 吸附色譜：利用物理吸附性能的差異。（Adsorption chroma

3、tography） 離子交換色譜：利用離子交換原理。（Ion exchange chromatography） 空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同。（Steric exclusion chromatography） 毛細(xì)管電泳法：利用組分電泳速度差異。（Capillary electrophoresis）色譜法簡(jiǎn)單分類：四、色譜法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”缺點(diǎn)： 高選擇性：可將性質(zhì)相似的組分分開； 高效能：反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好分離效果； 高靈敏度：10-1110-13g，適于痕量分析； 分析速度快：幾幾十分鐘完成分離一次可以測(cè)多種樣品； 應(yīng)用范圍廣：氣體、液體、固體

4、物質(zhì)以及化學(xué)衍生化再色 譜分離、分析。 對(duì)未知物分析的定性專屬性差 需要與其他分析方法聯(lián)用（GC-MS、LC-MS）一、色譜過程、分離原理及特點(diǎn)（一）色譜過程 指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程。以吸附色譜為例:next 吸附 解吸再吸附 再解吸 反復(fù)多次洗脫被測(cè)組分分配系數(shù)不同 差速遷移 分離第二節(jié) 色譜法的基本原理next分配系數(shù)的微小差異吸附能力的微小差異微小差異積累較大差異吸附能力弱的組分先流出； 吸附能力強(qiáng)的組分后流出。back（二）色譜分離原理 色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異。 平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來衡量。（三）色譜分離特點(diǎn) 1不同組分通過色譜柱時(shí)的遷移速

5、度不等提供了 分離的可能性。 2各組分沿柱子擴(kuò)散分布峰寬不利于不同組 分分離。二、基本類型色譜法的分離機(jī)制基本概念：固定相（Stationary phase） 流動(dòng)相（Mobile phase）（一）吸附色譜法（二）分配色譜法（三）離子交換色譜法（四）空間排阻色譜法（一）吸附色譜法要求： 固定相為吸附劑（硅膠或Al2O3），具表面活性吸附中心。分離機(jī)制：next吸附系數(shù)注：Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動(dòng)相的性質(zhì) 及溫度有關(guān) next吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm 分離機(jī)制： 各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心； 利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離。吸附解吸再吸

6、附再解吸無(wú)數(shù)次洗脫分開。 back吸附色譜分離示意圖（二）分配色譜法要求： 固定相：機(jī)械吸附在惰性載體上的液體； 流動(dòng)相：必須與固定相不為互溶； 載體：惰性，性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。分離機(jī)制 next 注：K與組分的性質(zhì)、流動(dòng)相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì) 以及柱溫有關(guān) next分配系數(shù)分離機(jī)制 利用組分在流動(dòng)相和固定相間溶解度差別實(shí)現(xiàn)分離。 連續(xù)萃取過程 back液液色譜分離示意圖（三）離子交換色譜法要求：固定相：離子交換樹脂； 流動(dòng)相：水為溶劑的緩沖溶液； 被分離組分：離子型的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物。分離機(jī)制 next選擇性系數(shù) RSO3-H+ + M+ RSO3-M+ + H+ 注：K

7、s與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動(dòng)相性質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān) next 固定離子可交換離子待測(cè)離子分離機(jī)制： 依據(jù)被測(cè)組分與離子交換劑交換能力（親和力） 不同而實(shí)現(xiàn)分離 。 back陽(yáng)離子交換樹脂交換示意圖（四）空間排阻色譜法 要求： 固定相：多孔性凝膠； 流動(dòng)相：水（凝膠過濾色譜）； 流動(dòng)相：有機(jī)溶劑（凝膠滲透色譜 ）。 分離機(jī)制 next滲透系數(shù) 注：Kp 僅取決于待測(cè)分子尺寸和凝膠孔徑大小， 與流動(dòng)相的性質(zhì)無(wú)關(guān)。 next 分離機(jī)制： 利用被測(cè)組分分子大小不同、在固定相上選擇性 滲透實(shí)現(xiàn)分離。 back凝膠色譜分離示意圖 結(jié) 論： 四種色譜的分離機(jī)制各不相同，分別形成吸附平衡

8、、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡。 K分別為吸附系數(shù)，分配系數(shù)，選擇性系數(shù)和 滲透系數(shù)。 除了凝膠色譜法中的K僅與待測(cè)分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關(guān)外，其他三種K值都受組分的性質(zhì)、流動(dòng)相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫的影響。第三節(jié) 色譜法的歷史與展望一、歷史： 30年代 茨維特分離綠葉色素； 40年代 TLC、紙色譜； 50年代 GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能； 60年代 GC-MS出現(xiàn)有效彌補(bǔ)了色譜定性能力差的弱點(diǎn)； 70年代 HPLC出現(xiàn)使色譜分析范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。 二、發(fā)展與展望： 1新型固定相和檢測(cè)器； 2新方法的研究； 3聯(lián)用技術(shù)：GC-MS、HPLC-MS、CE-MS、GC-F

9、TIR、HPLC-NMR 4. 智能化、色譜專家系統(tǒng)：色譜柱的選擇、評(píng)價(jià)、樣品處理方法、分離條件的優(yōu)化以及在線定性、定量及結(jié)果解析等。熱力學(xué)理論：塔板理論平衡理論 動(dòng)力學(xué)理論：速率理論Vander方程 基礎(chǔ)第四節(jié) 色譜法的基本理論一、基本概念二、等溫線三、塔板理論（平衡理論）四、速率理論理論基礎(chǔ)一、基本概念1流出曲線和色譜峰2基線、噪音和漂移3保留值：色譜定性參數(shù)4色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參數(shù) 1流出曲線和色譜峰流出曲線（色譜圖）：電信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線。色譜峰：流出曲線上突起部分。不對(duì)稱因子正常峰（對(duì)稱）非正常峰 前峰 拖尾峰色譜峰fs在0.951.05之間fs小于0.95fs大于1.0

10、52基線、噪音和漂移 基線：當(dāng)沒有待測(cè)組分進(jìn)入檢測(cè) 器時(shí)，反映檢測(cè)器噪音隨 時(shí)間變化的曲線（穩(wěn)定 平直直線）。噪音：儀器本身所固有的，以噪 音帶表示（儀器越好，噪音越 小）。漂移：基線向某個(gè)方向穩(wěn)定移動(dòng) （儀器未穩(wěn)定造成）。3保留值：色譜定性參數(shù)保留時(shí)間tR：從進(jìn)樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí) 所需時(shí)間，即組分通過色譜柱所需要的時(shí)間。死時(shí)間t0 ：不被固定相溶解或吸附的組分的保留時(shí) 間（即組分在流動(dòng)相中的所消耗的時(shí)間），或流 動(dòng)相充滿柱內(nèi)空隙體積占據(jù)的空間所需要的時(shí) 間，又稱流動(dòng)相保留時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間tR：組分的保留時(shí)間與死時(shí)間之差值，即組分在固定相中滯留的時(shí)間。4色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參

11、數(shù)峰寬W：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點(diǎn)切線與基線相交 的截距。標(biāo)準(zhǔn)差：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點(diǎn)距離的一半； 對(duì)應(yīng)0.607h 處峰寬的一半。 小，峰窄，柱效高。 除了用于衡量柱效，還可以計(jì)算峰面積。半峰寬W1/2：峰高一半處所對(duì)應(yīng)的峰寬。基線tR0.607h色譜峰2tRt0W1/2hW信號(hào)時(shí)間 t保留體積VR：從進(jìn)樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí) 所消耗的流動(dòng)相的體積。 死體積V0 ：不被保留的組分通過色譜柱所消耗的流 動(dòng)相的體積。（也指色譜柱中未被固定相所占據(jù)的空隙體積，即色譜柱的流動(dòng)相體積，包括色譜儀中的管路、連接頭的空間、以及進(jìn)樣器和檢測(cè)器的空間）調(diào)整保留體積VR：保留體積與死體積之差，即組分停留在

12、固定相時(shí)所消耗流動(dòng)相的體積。相對(duì)保留值r 2,1（選擇性系數(shù)）：調(diào)整保留值之比。保留指數(shù)Ix ：指將待測(cè)物的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保留行為（已知范圍內(nèi)組分的定性參數(shù)）分離度：相臨兩組分間峰頂間距離與峰底寬平均值之 比（衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)）。討論5相平衡參數(shù) 容量因子k（容量比，分配比）：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的質(zhì)量比更易測(cè)定。分配系數(shù)K ：6. tR與K和k的關(guān)系 K、k 與保留值之間的關(guān)系公式推導(dǎo)：當(dāng)組分的色譜峰最高點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，根據(jù)物料平衡：流出量柱內(nèi)量 討論： 色譜條件一定時(shí)，tR主要取決K或k的大?。ㄉV法基本的定性參數(shù) ）。

13、K，tR ，組分后出柱 K=0，組分不保留 K ，組分完全保留二、等溫線：指一定溫度下，某組分在兩相中分配達(dá)平衡時(shí)，在兩相中的濃度關(guān)系曲線。1線性等溫線（理想） 固定相表面活性吸附中心未達(dá)飽和，K一定，與溶質(zhì)濃度無(wú)關(guān)。 固定相表面活性吸附中心不均，K不同先占據(jù)強(qiáng)吸附中心再占據(jù)弱吸附中心，K隨著溶質(zhì)濃度的增加而減小。 溶質(zhì)與固定相作用，改變其表面性質(zhì)，K隨著溶質(zhì)濃度的增加而增加。 等溫線與色譜峰形狀拖尾峰斜率=K2非線性等溫線（2）凹形前沿峰（1）凸形拖尾峰前沿峰對(duì)稱峰問題：色譜分離的基本理論基礎(chǔ)： 熱力學(xué)過程（組分和固定相的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）； 動(dòng)力學(xué)過程（動(dòng)力學(xué)因素與柱效的關(guān)系）； 色譜分離的評(píng)價(jià)

14、、色譜條件優(yōu)化及數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。 色譜理論：塔板理論和速率理論。 組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？ 組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制； 色譜峰變寬：色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制。三、塔板理論 色譜柱為有若干塔板高度為H的塔板組成的填料塔；每塊塔板兩相間分配達(dá)平衡；多次分配平衡后K小的先出柱；K 有微小差異的組分可獲較好分離。假想（一）塔板理論的四個(gè)基本假設(shè)在柱內(nèi)一小段高度內(nèi)組分分配瞬間達(dá)平衡（H理論塔板高度）；載氣非連續(xù)而是間歇式（脈動(dòng)式）進(jìn)入色譜柱，每次進(jìn)氣一個(gè)塔板體積；樣品和載氣均加在第0號(hào)塔板上，且忽略樣品沿柱方向的縱向擴(kuò)散；分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。（二）色譜峰的二項(xiàng)式分布 （N

15、 較少）逆流分布 萃取法利用物質(zhì)在互不相溶兩相中溶解度的不同。溶質(zhì)含量分布服從二項(xiàng)式分布： 設(shè)載氣中溶質(zhì)含量為q，固定相中的溶質(zhì)含量為p。如果 K0.5，則（三）色譜峰的正態(tài)分布（N50次）近似對(duì)稱分布討論： （四）理論板數(shù)和理論塔板高度的計(jì)算 理論塔板高度H ：為使組分在柱內(nèi)兩相間達(dá)到一次分配平衡所需要的柱長(zhǎng)。理論塔板數(shù) n ：組分流過色譜柱時(shí)，在兩相間進(jìn)行平衡分配的總次數(shù)。討論注意： 計(jì)算n與組分有關(guān)，不同組分其n 值不同； n無(wú)量綱，tR與W 或 W1/2 單位必須一致。例： 在色譜柱長(zhǎng)為 2m 的 5%的阿皮松柱、柱溫為100 C，記錄紙速度為2.0 cm/min的色譜條件下，測(cè)定苯的

16、保留時(shí)間為1.5 min，半峰寬為0.20 cm，求理論塔板數(shù)。解：討論： neff 和Heff 扣除了死時(shí)間，更能真實(shí)地反映柱效 小 結(jié)1塔板理論的貢獻(xiàn)：從熱力學(xué)角度 解釋了色譜流出曲線的形狀和濃度極大點(diǎn)的位置； 闡明了保留值與K 的關(guān)系； 提出了評(píng)價(jià)柱效高低的n 和H 的計(jì)算式。2. 在比較相似柱的柱效時(shí)有用； 必須在給定條件，指定組分測(cè)定時(shí)才有意義。四、速率理論 成功之處：塔板理論描述了組分在柱內(nèi)的分配平衡和分離過程、導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型、解釋了流出曲線形狀和位置、提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)。存在問題:做出了四個(gè)與實(shí)際不相符的假設(shè)，忽略了組分在兩相中傳質(zhì)和擴(kuò)散的動(dòng)力學(xué)過程；只定性給出塔

17、板高度的概念，卻無(wú)法解釋板高的影響因素；排除了一個(gè)重要參數(shù)流動(dòng)相的線速度u，因而無(wú)法解釋柱效與流速關(guān)系更無(wú)法提出降低板高的途徑。（一）塔板理論優(yōu)缺點(diǎn)塔板理論是在理想情況下導(dǎo)出的，未考慮分子擴(kuò)散因素、其它動(dòng)力學(xué)因素對(duì)柱內(nèi)傳質(zhì)的影響。因此它不能解釋： 峰形為什么會(huì)擴(kuò)張？ 影響柱效的動(dòng)力學(xué)因素是什么？可以發(fā)現(xiàn)：（二）Van Deemteer 方程式吸收了塔板理論的有效成果H，n從動(dòng)力學(xué)角度較好地解釋了影響柱效的因素渦流擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻抗項(xiàng)1. 渦流擴(kuò)散項(xiàng)A（多徑擴(kuò)散項(xiàng)）：產(chǎn)生原因：載氣攜樣品進(jìn)柱，遇到來自固定相顆粒 的阻力路徑不同渦流擴(kuò)散 next影響因素：固體顆粒越小，填充越實(shí)，A項(xiàng)越小 討

18、論： 注：顆粒太小，柱壓過高且不易填充均勻 填充柱60100目 空心毛細(xì)管柱（0.10.5mm），A=0，n 較高nextnextback填料粒徑與理論塔板高度的關(guān)系 色譜柱填料的粒徑越小理論塔板高 度可降低（峰 變得尖銳）；在高線速度區(qū) 域，柱效的降 低得以緩和。線速度理論塔板高度曲線分析條件流動(dòng)相 ：水/乙腈 （30/70，v/v）溫度：40 檢測(cè)：245 nm樣品：烷基苯酮back2. 縱向擴(kuò)散項(xiàng) B/u （分子擴(kuò)散項(xiàng)）：產(chǎn)生原因： 峰在固定相中被流動(dòng)相推動(dòng)向前、展開 兩邊濃度差 要為降低縱向擴(kuò)散，宜選用分子量較大的載氣、 控制較高線速度和較低的柱溫選擇載氣原則：兼顧分析時(shí)間和減小縱向擴(kuò)散 u 較小時(shí)，選M較大的N2氣（粘度大）； u 較大時(shí)，選M較小的H2氣、He氣（粘度?。Ｓ绊懸蛩兀?討論： 3. 傳質(zhì)阻抗項(xiàng)：C u產(chǎn)生原因：樣品在氣液兩相分配，樣品未及時(shí)溶解 就被帶走，從而造成峰擴(kuò)張。影響因素：