常用分子生物學技術(shù)課件

1、哈爾濱醫(yī)科大學藥學院生物制藥教研室第六章 常用分子生物學技術(shù)第一節(jié) 分子雜交技術(shù) 分子雜交技術(shù)：是利用單鏈核酸堿基互補配對，抗原與抗體、受體與配體、蛋白與其他分子的相互作用進行目的核酸、蛋白質(zhì)檢測的技術(shù)。分子雜交技術(shù)檢測方法探針標記物一、同位素（如32P、35S等）二、熒光基團三、發(fā)光基團四、生物素五、地高辛一、Southern印跡二、Northern印跡三、Western印跡四、原位雜交五、生物芯片學習內(nèi)容Southern印跡：是將DNA片斷從電泳凝膠上直接轉(zhuǎn)移至膜支持物（如硝酸纖維素膜、尼龍膜）上，固定DNA片段，并用標記的探針進行雜交，以檢測目的DNA的技術(shù)。現(xiàn)已成為基因組DNA特異序列

2、定位、檢測目標DNA的通用方法。一、Southern印跡Edwin Mellor SouthernDNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡法堿液（NaOH）在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測。主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子的大小。二、Northern印跡Northern印跡法 Western blot 又稱蛋白質(zhì)印跡法，是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或

3、生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。三、Western印跡Western Blot基本原理在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。Western-blot有何應用呢？檢測樣品中特異蛋白存在與否細胞中特異蛋白的半定量分析蛋白質(zhì)分子相互作用的研究DNA重組技術(shù)siRNA的轉(zhuǎn)染技術(shù)表觀遺傳學（甲基化，miRNA）凡是涉及蛋白水平檢測的研究，均可運用到western blot技術(shù)能做什么？Western Blot 流程蛋白樣品的制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色收集蛋白樣品使用

4、適當?shù)牧呀庖?，如RIPA裂解液等，裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。測定蛋白樣品的的蛋白濃度。2.SDS電泳氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。 E凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212 作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小灌制分離膠 隔絕空氣 ddH2O灌制濃縮膠 插入梳子 3.轉(zhuǎn)膜原理：蛋白

5、因結(jié)合SDS而帶電荷，轉(zhuǎn)膜即在電 場作用下蛋白質(zhì)從膠中轉(zhuǎn)至膜上的過程。轉(zhuǎn)膜 半干轉(zhuǎn)濕 轉(zhuǎn)半干式轉(zhuǎn)膜速度快，適合與小分子量蛋白濕式成功率高并特別適合用于分子量大于 100KD的蛋白兩種方法的轉(zhuǎn)膜液不同！方法 儀器 特點轉(zhuǎn)膜準備轉(zhuǎn)膜 制作“三明治”轉(zhuǎn) 膜 轉(zhuǎn)膜條件：推薦：100V ，12小時；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。轉(zhuǎn)膜 轉(zhuǎn)膜后檢測：（立春紅染色） 為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，可用相關(guān)染料對膜進行染色。1x立春紅5min染色前染色后轉(zhuǎn) 膜 為避免作為檢測試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理。5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）West

6、ern Blot 膜封閉液（生物試劑公司）4.封 閉 5.免疫反應,顯色一抗、二抗孵育分子生物學中使用的標記方法原位雜交：將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。四、原位雜交五、生物芯片生物芯片是將核酸、多肽或蛋白質(zhì)分子、組織切片和細胞等做成探針，以預先設(shè)計的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等載體上，構(gòu)成二維分子列陣，然后與待測生物樣品靶分子雜交，通過檢測雜交信號實現(xiàn)高效、快速、高通量樣品檢測?！叭祟惢蚪M計劃”的迫切需求： 30億個堿基對、10萬個基因的信息分析理想的解決方案 生物芯片：新的快速價廉的基因測序和功能研究方法1

7、992年第一張基因芯片此后系列生物芯片相繼問世生物芯片的發(fā)展歷史生物芯片研究學科的緊密交叉分子生物學生物信息學醫(yī) 學藥 物 學化 學材 料 學微 流體力學微 電 子 學物 理 學高度并行性：提高實驗進程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀。多樣性：可進行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。微型化：減少試劑用量和反應液體積，提高樣品濃度和反應速率。自動化：降低成本，保證質(zhì)量。生物芯片的特點生物芯片的分類基因芯片蛋白質(zhì)芯片細胞芯片組織芯片基因芯片（gene chip），又稱DNA微陣列（microarray），是基于核酸、探針互補雜交技術(shù)的原理，將大量的寡核苷酸片段按預先涉及的排列方式固定在載體表面

8、如硅片或玻璃片上，并以此為探針，在一定的條件下與樣品中待測的靶基因片段或DNA序列雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來實現(xiàn)對靶序列信息的快速檢測和分析基因芯片（DNA微陣列）基因芯片熒光標記的樣品 共聚焦顯微鏡獲取熒光圖象雜交結(jié)果分析探 針 設(shè) 計雜交基因芯片原理基因芯片技術(shù)主要步驟芯片制備把探針固定于載體表面樣品制備目標分子富集分子間的雜交結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析探針的設(shè)計：根據(jù)應用目的不同，設(shè)計不同的固定于芯片上的探針。探針在芯片上的布局：選擇合適的方式將探針排布在芯片上。1、芯片制備原位合成法：采用光刻原位化學合成技術(shù)，在玻片、硅片等載體表面合成寡核酸探針點陣。該方法適用于商品化、規(guī)模化高密度

9、基因芯片制備。點樣法：利用手工或自動點樣裝置將寡核苷酸鏈探針、cDNA或基因組DNA點在經(jīng)特殊處理的載體上，包括接觸法和噴墨法兩種，適用于自行制備點陣規(guī)模適中的基因芯片。基因芯片的制備方法生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的DNA，然后用熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。2、樣品制備樣品的分離純化DNA , mRNA擴增PCR, RTPCR，固相PCR標記等過程熒光標記（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性標記雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行的反應產(chǎn)生一系列信息的過程。選

10、擇合適的反應條件能使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。3、雜交反應4、結(jié)果分析芯片與標記的靶DNA或RNA雜交后，或與標記的靶抗原或抗體結(jié)合后，可采用下列方法分析處理數(shù)據(jù)：共聚焦掃描儀：應用最廣，重復性好但靈敏度較低。質(zhì)譜法：快速、精確，可準確判斷是否存在基因突變和精確判斷突變基因的序列位置。探針合成較復雜?；瘜W發(fā)光、光導纖維、二極管方陣檢測、直接電荷變化檢測等。 芯片掃讀裝置根據(jù)采用的光電偶合器件，分為光電倍增管型和CCD型。根據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光。應用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好的定位功能，可定量，應用廣泛。基因芯片技術(shù)

11、在醫(yī)學中的應用基因表達分析 基因型、基因突變和多態(tài)性分析 疾病診斷：遺傳性、感染性、腫瘤 藥物篩選 指導用藥及治療方案 預防醫(yī)學 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片也稱蛋白質(zhì)微陣列（protein microarray）,是將已知多肽、蛋白質(zhì)固定于硅片、玻片等支持介質(zhì)上，支撐高密度的多肽分子或蛋白質(zhì)分子的微陣列，利用抗原與抗體、受體與配體、酶與底物、蛋白質(zhì)與其它小分子之間的相互作用，檢測分析多肽、蛋白質(zhì)的一項技術(shù)。根據(jù)制作方法和應用的不同，蛋白質(zhì)芯片分為兩種：蛋白質(zhì)功能芯片：研究蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)修飾、 DNA- 蛋白質(zhì)間、 RNA- 蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、小分子蛋白質(zhì)等相互作用的芯

12、片。它是將所研究體系中的每種天然蛋白質(zhì)點加在基片上制成芯片 , 用于天然蛋白質(zhì)活性及分子親和性的高通量平行研究。 蛋白質(zhì)檢測芯片：蛋白質(zhì)檢測芯片是將具有高度親和特異性的探針分子 固定在基片上 , 用以識別復雜生物樣品溶液 ( 如細胞提取物 ) 中的目標多肽 , 當放射性同位素或熒光標記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后 , 通過激光共聚焦掃描或電荷耦合檢測裝置 (CCD) 對信號的強度進行檢測 , 從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)技術(shù)主要步驟提出生物學問題（實驗目的）樣品預處理（重組蛋白，制備一、二級抗體，熒光標記，配蛋白印記緩沖液）生化反應化學偶合，加底物，反應溫度和時間，沖洗條件

13、檢測（熒光和比色掃描或拍照，參數(shù)設(shè)置）數(shù)據(jù)分析（圖象量化，標準化，采集蛋白信息，建立模型）12345蛋白質(zhì)芯片制備6蛋白質(zhì)芯片的應用疾病診斷和預警藥物開發(fā) 蛋白質(zhì)的篩選及研究定量檢測組織提取液中的腫瘤標記物Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 14271436.孵育后的微陣列熒光圖 A 含抗原 B 無抗原微陣列方法與ELISA方法檢出結(jié)果比較疾病診斷uPA 尿激酶型纖溶酶原激活因子PAI-1血漿纖溶酶原激活因子抑制因子VEGT 血管內(nèi)皮生長因子 人動脈平滑肌細胞蛋白譜Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 12741280.蛋白質(zhì)組學揭示了oxidized low density l