臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)

1、臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科楊澤華新的臨床項(xiàng)目開展通常需要進(jìn)行一下工作：方法學(xué)性能的評(píng)價(jià)1.精密度評(píng)價(jià)：2.準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)：3.最低檢測限4. 線性范圍5.試劑的穩(wěn)定性6.抗干擾性能7.參考區(qū)間診斷性能：1.靈敏度2.特異性一、定量檢測方法的精密度評(píng)價(jià)臨床上對(duì)病人標(biāo)本測定時(shí)，通常只是測定一次就發(fā)報(bào)告，這就是在臨床檢驗(yàn)中為什么將方法、儀器或檢測系統(tǒng)的精密度作為其性能的第一位的原因。現(xiàn)在一般推薦臨床檢測方法的批內(nèi)SD應(yīng)小于1/4TE，天間SD應(yīng)小于1/3TE 。在實(shí)際使用過程中，一臺(tái)儀器上可能進(jìn)行許多項(xiàng)目的檢測，決不能以一項(xiàng)檢測的精密度評(píng)價(jià)結(jié)果代替所有項(xiàng)目的評(píng)價(jià)結(jié)果。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)

2、委員會(huì)(NCCLS)，現(xiàn)更名為臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究院（CLSI），為臨床定量測定方法精密度的評(píng)價(jià)出版了EP-5文件，該文件經(jīng)多次修改，于1999年正式批準(zhǔn)，2004年在次修改，發(fā)布為EP-5A2文件。不精密度分為批內(nèi)不精密度、批間不精密度、天間不精密度、總不精密度。臨床醫(yī)師只關(guān)心總不精密度，而實(shí)驗(yàn)室工作人員便于分析問題，把總不精密度拆分為幾項(xiàng)。精密度評(píng)價(jià)方案：試劑和校準(zhǔn)品的選取標(biāo)本的選取標(biāo)本濃度的確定標(biāo)本數(shù)量持續(xù)時(shí)間試劑和校準(zhǔn)品的選取在整個(gè)評(píng)價(jià)過程中可以選取同一批號(hào)的試劑和校準(zhǔn)品，但是這樣會(huì)低估該實(shí)驗(yàn)室的精密度，最好使用使用不同批次的試劑和校準(zhǔn)品，以更加客觀地反映該實(shí)驗(yàn)室的精密度。評(píng)價(jià)標(biāo)本的選取

3、應(yīng)該選取與與臨床標(biāo)本具有相似性質(zhì)的材料。如果可能的話最好選用穩(wěn)定的冷凍保藏的混合血清。必要時(shí)也可以使用穩(wěn)定的商品化的人血清基質(zhì)質(zhì)控品。標(biāo)本濃度的確定通常推薦兩個(gè)濃度的標(biāo)本，當(dāng)然也可以使用更多濃度的標(biāo)本。在本方案中對(duì)兩個(gè)不同濃度的標(biāo)本分別進(jìn)行評(píng)價(jià)。兩個(gè)濃度值應(yīng)盡可能跨越測量范圍的大部分。如果使用兩個(gè)濃度以上，另外的濃度值盡可能與實(shí)驗(yàn)室使用的醫(yī)學(xué)決定水平相接近。如果想要與廠商說聲明的精密度值做比較，那么就應(yīng)該選取與廠商所采用的濃度接近的值。如果廠商要確立一個(gè)測定項(xiàng)目的精密度，應(yīng)該選取高、低、接近醫(yī)學(xué)決定水平的三個(gè)濃度分別進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果這三個(gè)濃度的精密度或者相對(duì)精密度一致，那么這三個(gè)濃度的結(jié)果就足以

4、說明問題。如果在這三個(gè)濃度處所獲得的結(jié)果不一致或者有較大的差異，那么為了更加全面的反映方法的性能，就應(yīng)該選取更多的濃度進(jìn)行評(píng)價(jià)。標(biāo)本數(shù)量為了正確地反映所評(píng)價(jià)方法的真實(shí)精密度，就需要足夠的數(shù)據(jù)。每天應(yīng)分析兩批。如果因?yàn)橘|(zhì)控或其他原因需要棄去一批測定，那么應(yīng)該在找到原因并且在糾正錯(cuò)誤之后重測一批。每個(gè)濃度的每批次測定應(yīng)測定兩次。每批都應(yīng)進(jìn)行質(zhì)控品的測定以確定數(shù)據(jù)的可接受性。每批測定應(yīng)改變標(biāo)本和質(zhì)控品的順序。為了更好地反映實(shí)際操作情況，如果可能的話，每批測定至少包括10份病人標(biāo)本。每天每批次之間的間隔時(shí)間至少為2小時(shí)。持續(xù)時(shí)間至少20天（不包括有離群值的測量日）本次講座以血清ADA的測定為例來說明儀

5、器的熟悉階段其中包括：儀器的操作、保養(yǎng)、標(biāo)本的制備、試劑的配置、定標(biāo)、儀器工作狀態(tài)的監(jiān)測等。儀器應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室安裝使用足夠長的時(shí)間以熟悉各種問題的解決辦法。對(duì)于決大多數(shù)儀器，5天時(shí)間就足夠了。根據(jù)儀器的復(fù)雜程度以及操作者的技能，該時(shí)間可長可短。評(píng)價(jià)程序的熟悉由于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中一些步驟在常規(guī)標(biāo)本檢測中并不碰到，為了避免這些步驟對(duì)精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的干擾，在正式評(píng)價(jià)之前應(yīng)實(shí)際進(jìn)行一段時(shí)間的實(shí)驗(yàn)。這有助于對(duì)評(píng)價(jià)方案的熟悉。此步驟應(yīng)進(jìn)行到輕松地獲取5天次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為止。在評(píng)價(jià)方案的熟悉階段快要結(jié)束時(shí)，應(yīng)進(jìn)行精密度的初步評(píng)價(jià)。進(jìn)行20次測定，理想情況下，進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)濃度的測定。儀器精密度的初步評(píng)價(jià)目的熟悉儀器的

6、操作初步判斷儀器的性能確立離群值判斷的界限如何進(jìn)行在熟悉評(píng)價(jià)程序之后，對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行20次測定，最好進(jìn)行兩個(gè)濃度的標(biāo)本的測定。計(jì)算SD和CV，如果與預(yù)期的差距較大，應(yīng)與廠商聯(lián)系，直到問題解決為止。初步評(píng)價(jià)結(jié)果二、利用病人標(biāo)本進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)和偏倚的估計(jì)實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備用一個(gè)檢測系統(tǒng)或測定方法進(jìn)行測定標(biāo)本前，應(yīng)和原有檢測系統(tǒng)或者公認(rèn)的參考方法一起檢測一批病人標(biāo)本，對(duì)測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用以估計(jì)新方法的偏倚，如果偏倚在允許范圍內(nèi)，說明使用新方法代替原有檢測系統(tǒng)不會(huì)引入明顯的偏倚，可以在臨床使用。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究院（CLSI），原來為NCCLS，致力于制定一系列評(píng)價(jià)臨床方法的文件。CLSI是一個(gè)全球

7、性、多學(xué)科、非贏利性的標(biāo)準(zhǔn)化和教育性團(tuán)體，旨在促進(jìn)醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程和應(yīng)用。CLSI的文件有以下三種形式：標(biāo)準(zhǔn)（Standard）指南（Guideline）報(bào)告（Report）多數(shù)CLSI文件可在2個(gè)水平上達(dá)成一致，即提議（Proposed），此類文件編號(hào)為P。批準(zhǔn)（Approved），編號(hào)為A。根據(jù)評(píng)價(jià)或數(shù)據(jù)收集的需要，部分文件也可以介于上述兩者之間，即暫定（tentative）。還有一類委員會(huì)報(bào)告，則是尚未通過一致化的文件，編號(hào)為R。目前CLSI公布的與方法學(xué)評(píng)價(jià)有關(guān)的文件主要有：EP（Evaluation protocol ）5-A 臨床化學(xué)精密度評(píng)價(jià)批準(zhǔn)指南。EP6-A 定量分

8、析方法的線性評(píng)價(jià)EP7-A 臨床化學(xué)干擾實(shí)驗(yàn)EP9-A2 用患者標(biāo)本進(jìn)行方法學(xué)比較和偏倚評(píng)估EP10-A2 定量實(shí)驗(yàn)方法的初步評(píng)價(jià)EP14-A 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)以BECKMAN DxC800和ROCHE MODULAR P模塊HDL-C測定比對(duì)為例來說明。（一） 首先確立比較方法和實(shí)驗(yàn)方法以Roche生化分析系統(tǒng)作為比較方法（Comparative method） (X)，Beckman DxC800 作為實(shí)驗(yàn)方法（Test method）(Y)。（二） 標(biāo)本的選取實(shí)驗(yàn)時(shí)間至少做5天，時(shí)間長一點(diǎn)更好；至少做40份標(biāo)本（如每天至少做8份病人標(biāo)本），多一點(diǎn)更好。盡可能使50%的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本分析物的含量在

9、參考區(qū)間外、可報(bào)告內(nèi)，各個(gè)標(biāo)本分析物含量越寬越好，進(jìn)行雙份測定，最后取平均值用于結(jié)果的計(jì)算。使用當(dāng)天采集的標(biāo)本，一份標(biāo)本不夠時(shí)可以將濃度相近的兩份標(biāo)本混合。（三 ）標(biāo)本的測定整個(gè)實(shí)驗(yàn)必須有室內(nèi)質(zhì)量控制，失控時(shí)不能進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)。比對(duì)標(biāo)本最好在相同時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定，一般應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成檢測。標(biāo)本按1、2、3、4、5、6、7、8順序排列先測一遍，然后將順序倒過來進(jìn)行第二次檢測。（四） 數(shù)據(jù)的上報(bào)和離群值的檢驗(yàn)比對(duì)結(jié)果應(yīng)以兩種方式上報(bào)，一種為打印結(jié)果，另一種為Excel格式的電子版結(jié)果。方法內(nèi)離群點(diǎn)的檢驗(yàn)按以下公式分別計(jì)算每個(gè)標(biāo)本用比較方法和實(shí)驗(yàn)方法兩次重復(fù)測定的差值的絕對(duì)值，Xi=|xi1-xi2|Y

10、i=|yi1-yi2|這里i代表標(biāo)本號(hào)，總共的標(biāo)本數(shù)量為N。按以下方法計(jì)算上述絕對(duì)值的平均值，方法間離群值的檢驗(yàn)（五）散點(diǎn)圖的繪制（六 ）X數(shù)據(jù)范圍是否足夠?qū)挼墓烙?jì)（七） 回歸方程的計(jì)算（八） 計(jì)算偏倚的估計(jì)值及其相應(yīng)的95%可信區(qū)間（九） 結(jié)果的解釋三、臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目檢測限的建立 ：意義：一些項(xiàng)目的靈敏度對(duì)于臨床具有重要的指導(dǎo)價(jià)值，比如腫瘤標(biāo)志物、毒物、感染性疾病標(biāo)志物、hsCRP、cTnI、TSH等，檢測靈敏度是這些項(xiàng)目的重要性能指標(biāo)。以TSH檢測試劑盒的發(fā)展為例：第一代TSH檢測試劑盒：為采用離心沉降技術(shù)的放免試劑，分析靈敏度為1-2mIU/L；由于靈敏度太低，對(duì)甲亢的診斷意義不大；第二代

11、TSH檢測試劑盒：采用固相放射免疫技術(shù)，分析靈敏度為0.1-0.2mIU/L；由于具有較好的靈敏度，因此在甲亢的診斷中開始發(fā)揮作用；第三、四代TSH檢測試劑盒；都使用了化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)，分析靈敏度分別可達(dá)0.01-0.02mIU/L和0.001-0.002mIU/L，比第一代試劑盒提高了2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，使其成為甲亢診斷的首選指標(biāo)。概念：空白限（limit of blank, LoB):空白樣品杯觀察到的最大檢測結(jié)果。檢出限（limit of detection, LoD):樣品中分析物的最小量，可以在規(guī)定的可能性條件下予以檢出，雖然也許還不能被量化為實(shí)際的值。定量限（limit of quan

12、titation,LoQ):樣品中分析物的最小量，在規(guī)定的可接受精密度和正確度下被定量地確定。正確度（truness）：大量檢測結(jié)果的均值和可接受參考值的一致性程度。正確度通常以偏倚表示。依據(jù)CLSI發(fā)布的EP17-A文件進(jìn)行?；静襟E：1.確定LoB的程序至少進(jìn)行60次空白測定，數(shù)據(jù)如果是正態(tài)分布，則LoB=X+1.645S;如數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，則LoB=Pct 。100-2.確定LoD的程序選擇4到6個(gè)濃度為LoB1到4倍LoB的低濃度樣本，至少獲得60個(gè)重復(fù)測定結(jié)果。如果是正態(tài)分布，則LoD=LoB+CS；如果是非正態(tài)分布LoD=LoB+DS,3.確定LoQ的程序?qū)?到5個(gè)不同樣品至少作

13、5批，至少40次檢測結(jié)果。實(shí)例：HBsAg檢測限的確立1.空白限的確立(LoB)0.0030.0030.0070.0050.0030.0030.0030.0040.0060.0030.0030.0040.0040.0100.0050.0030.0050.0030.0040.0100.0050.0040.0040.0030.0050.0110.0030.0040.0030.0050.0050.0130.0040.0030.0050.0030.0050.0060.0040.0070.0040.0040.0050.0130.0070.0050.0030.0040.0040.0150.0030.005

14、0.0030.0040.0040.0080.0050.0050.0030.005第95百分位數(shù)應(yīng)為95.5秩號(hào)的觀察結(jié)果：LoB=（0.013+0.011)/2=0.0122.檢出限(LoD)的建立：0.008 0.010 0.011 0.010 0.010 0.008 0.008 0.013 0.015 0.013 0.019 0.0130.019 0.019 0.019 0.016 0.022 0.015 0.018 0.015 0.024 0.018 0.018 0.0150.032 0.028 0.034 0.025 0.029 0.025 0.028 0.028 0.035 0.03

15、1 0.029 0.0280.032 0.036 0.039 0.040 0.042 0.045 0.038 0.038 0.036 0.042 0.040 0.0450.045 0.049 0.048 0.049 0.052 0.048 0.049 0.054 0.058 0.053 0.053 0.045LoD=LoB+DS,Ds,=中位數(shù)-第5百分位數(shù)的值=0.028-0.01=0.018LoD=0.018+0.012=0.0303.定量限(LoQ)的確立：預(yù)期樣本濃度 樣本數(shù) XSBias CV（%） TE0.0120.0210.030121212028.615.410.757.245

16、.124.70.120.0030.180.0030.290.00314.33.30.0390.048121209.67.319.218.80.390.0040.500.0044.2TE=Bias+2CV四、線性范圍的確立概念：線性范圍：檢測系統(tǒng)結(jié)果具有可接受線性的范圍，即：非線性誤差小于規(guī)定的誤差。線性：提供的檢測結(jié)果和檢測樣品中分析物濃度呈比例的能力。意義：對(duì)于病情觀察和療效評(píng)估具有重要意義。依據(jù)文件：EP-6A多項(xiàng)回歸：y=a+b1x（一次多項(xiàng)式或線性擬合）y=a+b x+b x2(二次多項(xiàng)式）12y+=a+b x+b x2+b x3(三次多項(xiàng)式)123基本步驟：標(biāo)本的制備檢測數(shù)據(jù)處理結(jié)果

17、分析根據(jù)散點(diǎn)圖對(duì)數(shù)據(jù)作出初步判斷根據(jù)統(tǒng)計(jì)回歸方程的標(biāo)準(zhǔn)誤進(jìn)行判斷，其中標(biāo)準(zhǔn)誤最小的回歸方程為最好擬合使用t檢驗(yàn)判斷回歸方程的非線性系數(shù)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義判斷每一個(gè)點(diǎn)的最佳回歸的預(yù)測值和線性預(yù)測值的差值是否在允許范圍內(nèi)實(shí)例：ALT線性范圍的確立表1 不同稀釋度樣本的配制方法1 2 3 4 5 678 9 10 11稀釋度L加入量（l） 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0H加入量（l） 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200稀釋度 第一次 第二次 平均值 差值差值百分?jǐn)?shù)12345678944 44 44 0211 211

18、211 000376 377 376 -1 -0.266522 524 523 -2 -0.382699 696 697 3827 840 833 -13 -1.560994 994 994 00.43001165 1172 1168 -7 -0.5991292 1302 1297 -10 -0.77110 1438 1458 1448 -20 -1.38111 1571 1570 1570 1 0.064繪制測定值的散點(diǎn)圖階別系數(shù)符號(hào)系數(shù)值系數(shù)SEt檢驗(yàn)自由度回歸標(biāo)準(zhǔn)誤1b0-90.382 7.682153.905 1.133-11.7652016.80012B1B0135.878-127.

19、0338.422-15.0831910.846223333B1B2B0B1B2B3170.821 3.22652.955-5.384-1.4100.262-108.46212.790-8.480 1817.61410.213155.481 8.8271.6521.6720.0920.988-0.170-1.851查t界值表，自由度為20、19、18的95%雙側(cè)t界值分別為2.086、2.093、2.101。測量均值一次多項(xiàng)預(yù) 三次多項(xiàng)預(yù) 線性偏 線性偏離百期值期值離分?jǐn)?shù)21.145 48.0578.459 4.0094463.523217.428371.333525.238679.14342.

20、378208.969372.740533.691691.822211376523697-1.407 -0.374-8.453 -1.616-12.679-1.818-1.690-1.275833994833.048986.953847.133999.624-14.085-12.67111681297144815701140.8581294.7631448.6681602.5731149.2951296.1461440.1771581.388-8.437 -0.722-1.383 -0.1078.4910.58621.185 1.349階別系數(shù)符 系數(shù)值 系數(shù)SE t檢驗(yàn) 自由回歸標(biāo)準(zhǔn)誤號(hào)度1b

21、0-5.837-1812.08398.93316.95112B1B0156.04 0.9412165.888-8.232-179.899119.93314.568223B1B2B0166.54 3.438248.439-0.955 0.305-3.134-13.967-1610.178116.7838.361333B1B2B3163.74 10.469 15.6491-0.349 2.159-0.162-0.037 0.129-0.284查t界值表，自由度為18、17、16的95%雙側(cè)t界值分別為2.101、2.110、2.120。測量均值一次多項(xiàng)預(yù) 二次多項(xiàng)預(yù) 線性偏 線性偏離百期值期值離分?jǐn)?shù)11.455 26.0343.820 1.8104457.10945.654211376523697833994116812971448213.151369.193525.235681.277837.319993.3611149.4031305.4451461.487209.331371.098530.955688.902844.939999.0661151.2831301.5901449.987-1.905 -0.506-5.720 -1.094-7