細(xì)胞生物學(xué)實驗醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)

1、醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo) 人民衛(wèi)生出版社PEOPLES MEDICAL PUBLISHING HOUSE主編 楊康鵑 王振華 人民衛(wèi)生出版社PEOPLES MEDICAL PUBLISHING HOUSE副主編 朱金玲 楊國華 黃 健 潘智芳 霍滿鵬編 委 （以姓氏筆畫為序） 王振華 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院馮衛(wèi)國 濰坊醫(yī)學(xué)院朱金玲 佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院 劉英芹 佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉金成 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊國華 武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊康鵑 延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院吳群英 桂林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院張 靜 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院 人民衛(wèi)生出版社PEOPLES MEDICAL PUBLISHING HOUSE張子波 延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 岳鳳珍

2、蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院金艷花 延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院金雄吉 延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院高志芹 濰坊醫(yī)學(xué)院黃 健 桂林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院蔣林彬 桂林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院蒲力群 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院慕明濤 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院潘智芳 濰坊醫(yī)學(xué)院霍滿鵬 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗一顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用方法一、目的要求(一)熟悉普通光學(xué)顯微鏡的主要構(gòu)造、成像原理、操作 方法，掌握低倍鏡、高倍鏡和油鏡的使用方法。(二)了解其他類型的光學(xué)顯微鏡成像原理和應(yīng)用范疇。(三)了解電子顯微鏡的工作原理及構(gòu)造，初步了解電鏡 樣品的制備技術(shù)和方法。 二、實驗內(nèi)容（一）普通光學(xué)顯微鏡 實驗原理： 光鏡是根據(jù)光學(xué)原理，采用一組玻璃透鏡制作而成。外部光 線經(jīng)反光鏡反射入

3、聚光鏡，聚光鏡將光線會聚在被觀察的標(biāo) 本上，照亮標(biāo)本，便于觀察。當(dāng)光線透射標(biāo)本進(jìn)入物鏡后， 物鏡將標(biāo)本作第一次放大，形成一個倒立的實像。光線再經(jīng) 過目鏡進(jìn)入人眼,目鏡將第一次放大的實像作第二次放大,此 時便在人的視野中得到一個放大的倒立虛像，成為顯微鏡的 觀察圖像。 光學(xué)顯微鏡的成像原理模式圖 普通光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖 1.光鏡的基本構(gòu)造與性能 不同型號的光學(xué)顯微鏡示例 （1）低倍鏡的使用（2）高倍鏡的使用（3）油鏡的使用2.光學(xué)顯微鏡的使用方法（1）字母裝片的觀察 （2）毛發(fā)交叉裝片的觀察 （3）血涂片的觀察 3.低倍鏡、高倍鏡和油鏡的使用練習(xí) （1）取用顯微鏡要避免目鏡和其他零部件滑落；

4、（2）目鏡不可隨便取出以免灰塵落入鏡內(nèi)影響觀察； （3）顯微鏡的光學(xué)部件清洗時只能用擦鏡紙輕輕向一 個方向擦拭，不可用紗布、手帕或普通紙揩擦， 以免損壞鏡頭；4.注意事項（4）使用顯微鏡觀察標(biāo)本時，要注意不能一邊在目鏡 中觀察，一邊上升載物臺，以避免鏡頭與玻片接 觸，損壞鏡頭或玻片標(biāo)本。觀察時，應(yīng)兩同時眼 開、雙手并用，反復(fù)多次練習(xí)，做到能夠一邊觀 察，一邊計數(shù)或繪圖記錄；（5）顯微鏡使用完畢后應(yīng)及時復(fù)原,先下降載物臺,取 下玻片,使物鏡轉(zhuǎn)離透光孔，反光鏡垂直底座,然 后放回鏡箱。 4.注意事項 1.相差顯微鏡 2.暗視野顯微鏡 3.倒置顯微鏡 4.熒光顯微鏡 5.共聚焦顯微鏡（二）其他類型光

5、學(xué)顯微鏡 成像原理： 相差顯微鏡借助環(huán)狀光闌和相位板兩個 部件的作用，將相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劬?分辨的振幅差（明暗差）。光線經(jīng)過透 鏡會聚成束,發(fā)生互相疊加或互相抵消的干 涉現(xiàn)象,使原來透明的活體表現(xiàn)出肉眼 明顯可見的明暗區(qū)別。 1.相差顯微鏡 應(yīng)用范疇： 相差顯微鏡能夠比較清楚的觀察到活細(xì)胞 及活細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)甚至對細(xì)核、 線粒體等細(xì)胞器的動態(tài)研究，而無需對細(xì) 胞進(jìn)行固定和染色等處理。 1.相差顯微鏡 成像原理： 暗視野顯微鏡可用普通光鏡改裝而成，其聚光器底部的中央有一塊遮光板，使進(jìn)入反光鏡的中央光不能直射入物鏡，而僅允許光線從聚光器斜向照明被檢標(biāo)本，再經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡成像。使用時應(yīng)注

6、意物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑，否則會破壞或降低暗視場的照明。2.暗視野顯微鏡 應(yīng)用范疇： 這種顯微鏡能比較方便的觀察活體的細(xì) 胞或微小生物的運(yùn)動情況，但不能分辨 清楚其內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)。 2.暗視野顯微鏡 成像原理： 倒置顯微鏡的物鏡位于標(biāo)本的下方，而光源位于標(biāo)本的上方，即物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來。 應(yīng)用范疇： 其主要用于無色透明的活體觀察及細(xì)胞培養(yǎng)時觀察培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長情況。3.倒置顯微鏡倒置顯微鏡 成像原理： 熒光顯微鏡是利用一定波長的光（通常是波長短的紫外光和藍(lán)紫光）照射被檢標(biāo)本，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)物質(zhì)發(fā)出可見的熒光，通過物鏡和目鏡的放大成像，視野中呈現(xiàn)出熒光映像。 細(xì)胞內(nèi)大

7、部分物質(zhì)經(jīng)紫外光等短光波照射后，可發(fā)出較弱的熒光；但有些物質(zhì)需經(jīng)熒光染料染色后才能發(fā)出熒光,進(jìn)而對組織進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)的觀察和研究。 4.熒光顯微鏡熒光顯微鏡的主要部件：激發(fā)濾片可吸收可見光，產(chǎn)生單色光源；阻擋濾片可阻斷或吸收光路中的激發(fā)光或某些波長較短的光線，起到保護(hù)眼睛的作用。 4.熒光顯微鏡 應(yīng)用范疇： 觀察細(xì)胞內(nèi)經(jīng)紫外光等短光波照射后可發(fā) 出較弱的熒光的物質(zhì)；某些組織進(jìn)行細(xì)胞 化學(xué)的觀察和研究時有些物質(zhì)需經(jīng)熒光染 料染色后才能發(fā)出熒光。4.熒光顯微鏡發(fā)展史： 1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一臺共 焦顯微鏡，用來在體觀察大腦的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。 1957年，Marvin

8、Minsky申請了共聚焦顯微鏡的專利。 1970年，第一臺單光束共聚焦激光掃描顯微鏡問世。 1985年，多個實驗室的多篇報道顯示共聚焦顯微鏡可 以消除焦點(diǎn)模糊，得到清晰的圖像。 1987年，BIO-RAD公司推出了第一臺商業(yè)化的共聚焦 顯微鏡。 5.共聚焦顯微鏡激光器掃描頭系統(tǒng)控制塔 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)組成：倒置熒光顯微鏡激光器掃描頭系統(tǒng)控制塔電腦及顯示器 5.共聚焦顯微鏡 共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡原理的差異： （1）照明方式不同： 傳統(tǒng)顯微鏡是一次性照明整個視野中的樣品，因 此可以用眼睛直接觀察或者用 CCD 獲取圖像,沒 有時間延遲；而共聚焦顯微鏡是逐點(diǎn)成像，無法 用眼睛成像也無法用CCD獲

9、取圖像,只能用探測器 收集每個象素點(diǎn)的信號，再通過軟件重構(gòu)圖象， 有一定的時間延遲。 5.共聚焦顯微鏡 （2）共聚焦顯微鏡在探測器前面放置一個 pinhole（小孔) pinhole的作用： 用來阻止非焦面的信號，同時通過 焦面的信號，以消除焦點(diǎn)模糊。 使共聚焦顯微鏡具有了光切能力， 能對厚樣品進(jìn)行三維層切成像。 5.共聚焦顯微鏡 共聚焦顯微鏡功能： （1）用作高精度熒光顯微鏡 （2）獲取三維圖像 （3）獲取多熒光標(biāo)記圖像 5.共聚焦顯微鏡三維圖像多熒光標(biāo)記圖像 （4）時間序列掃描成像： 可對樣品進(jìn)行長時間的動態(tài)觀察，獲 取樣品不同時間的圖像。 5.共聚焦顯微鏡 （5）光譜掃描功能： 可拆分有

10、光譜重 疊的不同染料， 也可以獲取未知 染料的發(fā)射光譜 曲線。 5.共聚焦顯微鏡 （6）串色功能： 串色是指兩種或多種熒光染料的發(fā)射光譜互相重迭的現(xiàn)象：當(dāng)使用多種熒光染料標(biāo)記標(biāo)本時，或當(dāng)標(biāo)本具有很強(qiáng)的自發(fā)熒光時，很容易產(chǎn)生串色現(xiàn)象。 5.共聚焦顯微鏡（三）電子顯微鏡 電子顯微鏡（electron microscope）： 是使用電子來展示物件的內(nèi)部或表面的顯微 鏡.高速的電子的波長比可見光的波長短。電子 顯微鏡的分辨率約0.1nm，光學(xué)顯微鏡的分辨率 約0.2m。1.電子顯微鏡的組成 電子源 電子透鏡 真空裝置 樣品架 探測器 電子顯微鏡2.電子顯微鏡的工作原理 電子顯微鏡是利用高壓加速電子束

11、為照明源，在高真空系統(tǒng)中，快速電子照射樣品時，入射電子要與樣品物質(zhì)中的原子結(jié)構(gòu)發(fā)生碰撞作用，原子核與核外層電子都會對入射電子有碰撞引起的散射，導(dǎo)致部分電子的運(yùn)動方向和能量變化.樣品中不同結(jié)構(gòu)不同區(qū)域致密度不同,散射程度也不盡相同，所以穿過樣品的初射束是不均勻的電子束，束內(nèi)電子密度各處互有差異，當(dāng)其投射到熒光屏上就會形成描繪結(jié)構(gòu)信息的可見光強(qiáng)度反差圖像。因此，電子顯微鏡的成像機(jī)理是散射。 3.電鏡樣品制備技術(shù)和方法超薄切片的制作步驟包括： 取材 固定 脫水 包埋 切片 染色 4.樣品的觀察、識別和分析 學(xué)習(xí)側(cè)插式樣品支架的使用方法，按儀器操作 說明書實際操作演示，并將準(zhǔn)備好的超薄切片 銅網(wǎng)放入支

12、架上。 給電鏡進(jìn)樣、啟動高壓獲得照明。假如電子光 學(xué)系統(tǒng)已經(jīng)對準(zhǔn)調(diào)好狀態(tài)，那就用樣品移動桿 選擇觀察視場，調(diào)節(jié)中間鏡電流到適當(dāng)?shù)姆糯?倍數(shù)。配合調(diào)節(jié)第二聚光鏡選擇合適的亮度, 開始觀察分析熒光屏上的結(jié)構(gòu)圖像。 預(yù)先選擇準(zhǔn)備好的動物或植物樣品切片供觀察 分析。實驗二細(xì)胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及其細(xì)胞計數(shù)和顯微測量前言 所有需觀察的細(xì)胞都應(yīng)放置到無色透明的載玻片上制備成臨時或永久玻片標(biāo)本后，才適于在光鏡下觀察，大多數(shù)情況下還需在細(xì)胞或組織上加蓋一張蓋玻片，以起到保護(hù)標(biāo)本和顯微鏡鏡頭等作用。 一、實驗?zāi)康模ㄒ唬┦煜す鈱W(xué)顯微鏡下植物細(xì)胞和動物細(xì)胞 的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。（二）掌握臨時制片和顯微繪圖的方法。（三）

13、熟悉細(xì)胞的計數(shù)和顯微測量方法。（四）掌握X染色質(zhì)標(biāo)本的制備方法。 （五）熟悉X染色質(zhì)的形態(tài)特征和計數(shù)方法。 1.器材： 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、消毒牙簽、吸水紙、擦 鏡紙、目鏡測微尺、鏡臺、測微尺、小鑷子、吸管、 解剖刀、牙簽、染色缸、紗布、吸水紙、擦鏡紙。 2.試劑： 1%伊紅染液、次甲基藍(lán)染液或1%碘液、生理鹽水、 固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、5mol/L的HCl溶液、 香柏油、乙醚、無水乙醇、硫堇染液或0.2 %甲苯胺 蘭染色液 3.材料： 洋蔥、人口腔黏膜上皮細(xì)胞二、實驗器材和試劑 （一）洋蔥表皮細(xì)胞臨時標(biāo)本的制備和觀察1.實驗方法 擦拭載玻片（如右圖）； 取一干凈載玻片，中央滴加

14、 伊紅染液一滴； 從洋蔥鱗莖內(nèi)側(cè)用刀在其凹 面劃一約4mm2的小塊，用鑷 子撕下很薄的一片表皮，置 于載玻片的染液中；三、實驗內(nèi)容、原理及其方法載玻片擦拭方法 將表皮展平放于染液中，用鑷子夾起潔凈 的蓋玻片，將它的一邊先接觸載玻片上的 染液，慢慢傾斜蓋上蓋玻片,注意防止產(chǎn) 生氣泡。（一）洋蔥表皮細(xì)胞臨時標(biāo)本的制備和觀察（2）洋蔥表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察: （一）洋蔥表皮細(xì)胞臨時標(biāo)本的制備和觀察低倍鏡下觀察（洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞排列整齊）細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞壁1.洋蔥表皮細(xì)胞臨時標(biāo)本的制備和觀察 高倍鏡下觀察細(xì)胞壁制備： 1) 在潔凈的載玻片中央，滴一滴甲基藍(lán)染液或碘液。 2) 用消毒牙簽的一端，在口腔側(cè)壁上輕

15、輕地刮幾下。 3) 將牙簽放在載玻片上的染液中涂勻。 4) 蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，用吸水紙吸去蓋玻片周 圍多余的液體。 5) 用顯微鏡觀察細(xì)胞形狀，細(xì)胞呈扁平鱗狀。（二）人口腔上皮細(xì)胞臨時標(biāo)本的制備及觀察（二）人口腔上皮細(xì)胞臨時標(biāo)本的制備及觀察結(jié)果觀察：細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì) 注意事項： 力度適中：過輕則刮取細(xì)胞量少，不 易觀察；過重則可能會引起口腔出血。 黏膜選擇：口腔內(nèi)粉紅色黏膜均可,以 下唇內(nèi)側(cè)黏膜最佳。（二）人口腔上皮細(xì)胞臨時標(biāo)本的制備及觀察（三）人體口腔頰部黏膜上皮細(xì)胞的顯微測量鏡臺測微尺目鏡測微尺鏡臺測微尺總長度為1mm,分為100個小格。鏡臺測微尺每小格實際長度=0.01mm=1

16、0m 012345678910目鏡測微尺 鏡臺測微尺目鏡測微尺的每格實際長度=鏡臺測微尺刻度/目鏡測微尺的刻度鏡臺測微尺每格實際長度=40/2010 m =20m（低倍鏡下）目鏡測微尺長度隨放大倍數(shù)發(fā)生改變！目境測微尺標(biāo)定方法（四）X染色質(zhì)標(biāo)本的制備、觀察1.實驗原理 X染色質(zhì)是女性細(xì)胞分裂間期核內(nèi)的一種特有染色質(zhì),位于核膜邊緣,一般呈三角形,半圓形或扁平形等，為異固縮小體。 正常女性間期核X染色質(zhì)出現(xiàn)率為1059 數(shù)目為X染色體的數(shù)目減1 通過進(jìn)一步計算 X染色質(zhì)陽性率，可以在胚胎期較為準(zhǔn)確的判斷胎兒性別,當(dāng)臨床上懷疑有 X 染色體數(shù)目異常時，也可以作為輔助診斷方法,對于沒有條件開展染色體檢

17、查的地區(qū)不失為一種經(jīng)濟(jì)實用的方案。 （四）X染色質(zhì)標(biāo)本的制備、觀察 2.實驗方法 (1)離心法 受檢者清水漱口后，以牙簽稍用力刮取口腔黏 膜細(xì)胞，用生理鹽水洗下，1000r/min,離心10分鐘, 棄上清液, 立即用3:1甲醇-冰醋酸固定液固定10分 鐘，在離心10分鐘,800r/min1000r/min，棄上 清液。然后，加入少許新配固定液，涂片法涂一均 勻薄層待干，將玻片標(biāo)本直接放入盛有0.2%甲苯 胺藍(lán)染液中，染色1分鐘，立即以流水沖洗，鏡檢。（四）X染色質(zhì)標(biāo)本的制備、觀察 (2)直接涂片法 受檢者用清水漱口后，以消毒牙簽的鈍頭刮取口腔頰部黏膜，將刮取的細(xì)胞均勻涂布在潔凈的載玻片上(約一

18、張蓋玻片大小),用記號筆標(biāo)記細(xì)胞面,不等涂布干燥，立即放入3：1甲醇-冰醋酸固定液中固定15分鐘后取出玻片標(biāo)本置于5mol/L的HCl中，水解15分鐘，充分沖洗，除去多余鹽酸。0.2%甲苯胺藍(lán)染液染色5分鐘，自來水沖洗，干燥后鏡檢。（四）X染色質(zhì)標(biāo)本的制備、觀察3.觀察 將制備好的標(biāo)本置于低倍鏡下觀 察，找到分散良好，彼此無重疊的細(xì)胞后，轉(zhuǎn)換高倍鏡，將細(xì)胞核完整、核內(nèi)染色均勻清晰無其他異固縮的濃染顆粒的細(xì)胞移至視野中央,加一滴香柏油觀察X染色質(zhì).在光學(xué)顯微鏡下可見到X 染色質(zhì)為一結(jié)構(gòu)輪廓清楚染色較深的小體，約在1m左右。（四）X染色質(zhì)標(biāo)本的制備、觀察高倍鏡下示X染色質(zhì)(1)刮口腔黏膜時,應(yīng)取較

19、深層細(xì)胞,因表層細(xì)胞已角質(zhì)化,X 染色質(zhì)出現(xiàn)率低；涂片時,牙簽應(yīng)平放在生理鹽水中沿一個方向滾動鋪開，鋪開的范圍以玻片的1/ 41/ 3 為宜,范圍太小細(xì)胞堆積發(fā)生重疊現(xiàn)象，范圍太大細(xì)胞很分散不便于觀察。(2)晾干時，最好自然風(fēng)干，如需酒精燈加熱,則玻片溫度不能太高,否則細(xì)胞變形（以玻片不燙手背為宜)。4.注意事項 （四）X染色質(zhì)標(biāo)本的制備、觀察(3) 沖洗玻片時,把玻片傾斜45,用細(xì)水從玻片的一端沖 洗，水流不能太大，也不能在玻片標(biāo)本中央沖洗，否 則會沖掉細(xì)胞，沖洗染料時應(yīng)徹底，否則影響觀察的 效果。(4) 固定液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,室溫下固定時間不能少于10min, 否則影響觀察效果。(5) 染色

20、時間應(yīng)控制在23 min(具體時間根據(jù)室溫高低 確定)。如染色時間短,X 染色質(zhì)著色不明顯;如染色 時間長,則其他染色質(zhì)也著色較深,均不能看清X染色 質(zhì)。 （四）X染色質(zhì)標(biāo)本的制備、觀察（五）實驗報告1. 繪制洋蔥表皮細(xì)胞、人口腔頰部黏膜上皮細(xì)胞， 并注明各部分結(jié)構(gòu)名稱。2. 列表記錄5個人口腔頰膜上皮細(xì)胞的長徑和短徑， 并算出其平均值。3. 分別求出使用低倍鏡(10)，高倍鏡(40)時目 鏡測微尺每格代表的長度。4. 在油鏡下觀察100個可計數(shù)細(xì)胞，統(tǒng)計X小體的頻 率，畫23個典型細(xì)胞，示X小體的形態(tài)和所處 部位。實驗三 細(xì)胞器的觀察 真核細(xì)胞內(nèi)存在多種具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞器，如：線

21、粒體、高爾基復(fù)合體、溶酶體、中心體、微管、微絲等。 有些細(xì)胞器體積較大，通過不同的染色方法可在光鏡下觀察到；而有些細(xì)胞器由于體積非常小，只能在電鏡下才能觀察到。通常把在光鏡下所見到的結(jié)構(gòu)稱為顯微結(jié)構(gòu)，電鏡下所見到的微細(xì)結(jié)構(gòu)則被稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。前言一、目的要求 （一）觀察并熟悉光鏡下線粒體、高爾基復(fù)合 體、中心體和細(xì)胞骨架的形態(tài)和分布。 （二）掌握人口腔黏膜細(xì)胞線粒體活體染色的原 理，了解其操作步驟。 （三）掌握洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞骨架標(biāo)本顯示方法 的原理，了解其操作步驟。 （四）掌握液泡系活體染色的原理，了解其操作 步驟。 （五）熟悉纖毛運(yùn)動的標(biāo)本制備及觀察方法。二、實驗器材和試劑1.

22、材料： 洋蔥鱗莖、人體口腔頰部黏膜上皮細(xì)胞。2. 儀器與用品： 光鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、載玻 片、蓋玻片、牙簽、小鑷子、吸管、解 剖刀、 牙簽、染色缸、紗布、吸水紙、 擦鏡紙。3.試劑： 1%伊紅染液、1%碘液、生理鹽水、固定 液、5mol/L的HCl溶液、香柏油、乙醚、 無水乙醇、0.2 %甲苯胺蘭染色液等。三、實驗內(nèi)容（一）高爾基復(fù)合體、線粒體、中心體標(biāo)本觀察 （二）人口腔黏膜細(xì)胞線粒體活體染色的標(biāo)本制 備及觀察 （三）洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞骨架標(biāo)本制備及觀察 （四）液泡系活體染色標(biāo)本制備及觀察 （五）纖毛運(yùn)動的臨時標(biāo)本制備及觀察 高爾基復(fù)合體在光鏡下呈網(wǎng)狀、點(diǎn)狀或線狀結(jié)構(gòu)。線粒體在光鏡下

23、呈線狀、粒狀、桿狀、圓形、啞 鈴形、星形、分枝狀等。 中心體在光鏡下呈球狀或點(diǎn)狀顆粒，包括中心粒和 中心粒旁物質(zhì)。（一）高爾基復(fù)合體、線粒體、中心體標(biāo)本觀察 1.高爾基復(fù)合體的觀察兔脊神經(jīng)節(jié)切片 在脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中高爾基復(fù)合體呈棕褐色顆粒狀、線狀或卷曲成網(wǎng)狀 低倍鏡下的兔脊神經(jīng)節(jié)高倍鏡下的兔脊神經(jīng)節(jié)油鏡下的兔脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞示高爾基復(fù)合體 1.高爾基復(fù)合體的觀察兔脊神經(jīng)節(jié)切片神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核高爾基復(fù)合體2.蟾蜍腎小管上皮細(xì)胞線粒體的觀察 在細(xì)胞質(zhì)中有許多被染成藍(lán)黑色的線狀或顆粒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。 低倍鏡下的蟾蜍腎小管上皮高倍鏡下的蟾蜍腎小管上皮油鏡下的蟾蜍腎小管上皮（示線粒體）2.蟾蜍腎小管

24、上皮細(xì)胞線粒體的觀察 在有絲分裂中、后期的受精卵的兩極各有一個被染成深藍(lán)色的小顆粒,即為中心粒。中心粒的周圍有一層較致密的物質(zhì),稱為中心粒旁物質(zhì)(中心球），中心粒和中心粒旁物質(zhì)共同組成中心體。 3.中心體的觀察馬蛔蟲子宮橫切片受精膜圍卵腔第一極體第二極體高倍鏡下的馬蛔蟲子宮橫切片低倍鏡下的馬蛔蟲子宮橫切片3.中心體的觀察馬蛔蟲子宮橫切片中心體有絲分裂中期和后期的受精卵示中心體3.中心體的觀察馬蛔蟲子宮橫切片第一極體第二極體中心體（二）線粒體標(biāo)本制備和觀察 1.實驗原理 詹納斯綠B（Janus Green B）是線粒體的專 一性活體染色劑。線粒體中細(xì)胞色素氧化酶 使染料保持氧化狀態(tài)而呈藍(lán)綠色，而

25、在周圍 的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。在 光鏡下很容易觀察到這種呈現(xiàn)特殊顏色的線 粒體。 2.實驗方法 滴2滴詹納斯綠B染液于玻片中央 用牙簽刮取口腔頰部黏膜細(xì)胞于染液中混勻 染色（5min10min） 加蓋玻片 觀察 （二）線粒體標(biāo)本制備和觀察 3. 結(jié)果觀察 光鏡下可見在接近無色的口腔黏膜上 皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中散布著一些藍(lán)綠色 的短桿狀或顆粒狀的線粒體。（二）線粒體標(biāo)本制備和觀察 （三）細(xì)胞骨架的制備與觀察洋蔥鱗莖表皮1.實驗方法：取材：洋蔥鱗葉表皮浸入PBS中5min，2%TritonX- 100處理（37，2030min）； M-緩沖液洗23次，每次5min； 3%戊二醛固定10m

26、in，PBS洗23次，3min；0.2考馬斯亮蘭染色8min;PBS洗23次,每次 3min; 鏡檢。2.結(jié)果觀察低倍鏡下的洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞高倍鏡下的洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞（三）細(xì)胞骨架的制備與觀察洋蔥鱗莖表皮油鏡下的洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞示細(xì)胞骨架（三）細(xì)胞骨架的制備與觀察洋蔥鱗莖表皮（四）液泡系活體染色標(biāo)本制備及觀察1.實驗原理 在動物細(xì)胞內(nèi)，凡是由膜所包圍的小泡和液泡除線粒體外全部屬于液泡系，包括高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、微體、消化泡、自噬小體、殘體、胞飲液泡和吞噬泡，都是由一層單位膜包圍而成。蟾蜍軟骨細(xì)胞內(nèi)含有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體，能合成與分泌軟骨粘蛋白及膠原纖維等，因而液泡系

27、發(fā)達(dá)。中性紅是液泡系特殊的活體染色劑，只將液泡系染成紅色，在細(xì)胞處于生活狀態(tài)時，細(xì)胞質(zhì)及核不被染色，中性紅染色可能與液泡中的蛋白質(zhì)有關(guān)。 顯微鏡下可見軟骨細(xì)胞為圓形或橢圓形，細(xì)胞核周圍有許多染成玫瑰紅色、大小不一的小泡，即液泡系（右圖箭頭所示）。2.實驗結(jié)果觀察（四）液泡系活體染色標(biāo)本制備及觀察液泡系（五）纖毛運(yùn)動臨時標(biāo)本制備及觀察 1.實驗原理 纖毛是細(xì)胞表面向外伸出的細(xì)長突出,長約510m，它是細(xì)胞表面的一種特化結(jié)構(gòu),具有復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和運(yùn)動功能。在哺乳動物中,纖毛只出現(xiàn)在一些特定的部位，如呼吸道和雌雄生殖管道等的上皮、腦室的室管膜細(xì)胞等處。 蟾蜍的上頜部黏膜上皮細(xì)胞表面排列密集的短而多的

28、纖毛，呈雙相搏動而使生理鹽水出現(xiàn)旋渦狀的纖毛移動現(xiàn)象。（五）纖毛運(yùn)動臨時標(biāo)本制備及觀察 1.實驗方法（1）肉眼觀察蠟屑移動： 用搗脊髓法將蟾蜍處死之后，立即將蟾蜍腹部朝上固定在蠟盤上，沿兩側(cè)口角向后剪開約1(用棉花止血)，將下頜翻轉(zhuǎn)固定在腹部，在上頜中線距喉頭1處放置蠟屑，觀察蠟屑移動。（五）纖毛運(yùn)動臨時標(biāo)本制備及觀察（2）纖毛臨時標(biāo)本片制備制片方法： 用眼科剪刀剪取咽頭前部的上頜黏膜約2mm2mm小塊，用小鑷子挾取剪下的黏膜，將縱切面貼于載玻片上，加一滴生理鹽水，再加蓋片。結(jié)果觀察： 顯微鏡下可見在黏膜上皮細(xì)胞表面排列密集的短而多的纖毛，呈雙相搏動而使生理鹽水出現(xiàn)旋渦狀的纖毛移動現(xiàn)象。 繪制

29、光鏡下線粒體、高爾基復(fù)合體、中心體和細(xì)胞骨架的形態(tài)和分布圖。用語言來描述顯微鏡下纖毛運(yùn)動的特點(diǎn)。繪制顯微鏡下蟾蜍胸骨劍突下軟骨液泡系的形態(tài)結(jié)構(gòu)。四、實驗報告細(xì)胞化學(xué)成分顯示 實驗四 一切細(xì)胞都是由蛋白質(zhì)（包括酶）、核酸、脂類及糖等成分所構(gòu)成，它們均具有不同的物理化學(xué)特性。應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)方法可對細(xì)胞內(nèi)多種化學(xué)成分進(jìn)行分析。 細(xì)胞化學(xué)(cytochemistry）技術(shù)是在保持細(xì)胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，加上一定試劑，使它與細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀物，再通過顯微鏡對組織內(nèi)的生物化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。前言一、目的要求（一）掌握血涂片及骨髓涂片制作方法。（二）掌握

30、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶顯示的原理、 化學(xué)成分顯示的方法、在細(xì)胞中的分布。（三）掌握堿性蛋白和酸性蛋白顯示的原理、化學(xué) 成分顯示的方法、在細(xì)胞中的分布。（四）掌握過氧化氫酶顯示的原理、化學(xué)成分顯示 的方法、在細(xì)胞中的分布。（五）掌握核酸顯示的原理、化學(xué)成分顯示的方法、 在細(xì)胞中的分布。二、實驗器材和試劑1. 材料： 小鼠腹腔液涂片、小鼠腎臟冰凍切片、 蟾蜍血涂片、家兔、馬鈴薯、洋蔥根尖。 2. 儀器與用品： 注射器、解剖剪、眼科剪、眼科鑷、恒 溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片、吸管、吸 水紙、染色缸、牙簽、染色缸、顯微鏡、 冰凍切片機(jī)。二、實驗器材和試劑3.試劑： 6淀粉肉湯、酸性磷酸酶作用液、甲醛鈣固

31、定 液、0.05ml/L醋酸緩沖液、 2硫化銨液、孵育液、2甲基綠水溶液、甘油明膠； 95乙醇、25三氯醋酸、0.2快綠、0.005Na2CO3、1/75mol/L HCl、總蛋白染色液（pH2.2）、堿性蛋白染色液（pH8.0）； 3%過氧化氫、0.1%鉬酸胺、生理鹽水、1%聯(lián)苯胺、聯(lián)苯胺混合液、0.5%硫酸銅溶液、1%番紅、甲基綠-派洛寧染液、醋酸緩沖液、純丙酮等。三、實驗內(nèi)容和實驗方法 堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的顯示 堿性蛋白和酸性蛋白的顯示 過氧化氫酶的顯示 DNA和RNA的顯示 （一）酸性磷酸酶的顯示1.實驗原理 酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是 一種在酸性pH

32、范圍內(nèi)能水解酸性單酯的酶。 主要存在于巨噬細(xì)胞，定位于溶酶體內(nèi),常 作為溶酶體的標(biāo)志酶.在溶酶體膜穩(wěn)定完整 時，底物（-甘油磷酸鈉）不易滲入,ACP 活力微弱或無活性。 經(jīng)固定，在合適pH條件下，膜本身變?yōu)椴环€(wěn)定，逐漸改變其滲透性，底物可以滲入，酶活力被顯示。此酶在pH5左右發(fā)生作用,能分解磷酸酯而釋放出磷酸基(PO43-)，PO43- 可與鉛鹽結(jié)合形成磷酸鉛沉淀，因其是無色的，需再與黃色的硫化胺作用，生成棕黑色PbS沉淀而被顯示出來。 -甘油磷酸鈉甘油PO43- PO43- Pb（NO3）2Pb3（PO4）2 Pb3（PO4）2（NH4）2SPbS（棕黑）（一）酸性磷酸酶的顯示 金屬沉淀法

33、小鼠每日腹腔注射6淀粉肉湯lml,連續(xù)3天； 第3天注射34小時后,處死小鼠，剖開腹腔,吸 取腹腔液，用冰片作臨時制片； 入37酸性磷酸酶作用液30min； 蒸餾水漂洗； 10甲醛鈣溶液后固定5min； 蒸餾水漂洗； 2硫化銨溶液35min； 蒸餾水漂洗； 晾干，鏡檢。2.實驗方法（一）酸性磷酸酶的顯示 對照實驗：入酸性磷酸酶作用液前先用高溫50處理30min，使酶失去活性，作好標(biāo)記,然后同時進(jìn)行上述過程?；?qū)φ战M的酸性磷酸酶作用液中不加-甘油磷酸鈉，而以蒸餾水代替。（一）酸性磷酸酶的顯示 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為不規(guī)則狀， 陽性細(xì)胞內(nèi)分布有棕褐色顆粒即 為酸性磷酸酶所在。3.結(jié)果分析（一）酸性磷酸

34、酶的顯示 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）在 堿性條件下 (pH9.09.4) 使孵育液中的底物 -奈酚磷酸鈉水解,產(chǎn)生-奈酚,后者再與偶 氮鹽偶聯(lián)生成不溶性耐曬染料。其最終顏色 因所用的偶氮鹽種類不同而異。 （二）堿性磷酸酶的顯示1.實驗原理 新鮮腎臟冰凍切片。 室溫下入孵育液20min左右。 蒸餾水洗數(shù)次。 2甲基綠復(fù)染細(xì)胞核10min。 水洗、晾干、甘油明膠封片。2實驗方法偶氮偶聯(lián)法(二）堿性磷酸酶的顯示 細(xì)胞質(zhì)中紫藍(lán)或紫黑色物質(zhì)即為堿性磷 酸酶所在，核為綠色。3.結(jié)果分析（二）堿性磷酸酶的顯示（三）堿性蛋白和酸性蛋白的顯示 1.實驗原理 以酸性氨基酸成分為主的蛋白

35、質(zhì)為酸性蛋白;以堿性氨基酸成分為主的蛋白質(zhì)為堿性蛋白。細(xì)胞核內(nèi)有組蛋白（堿性蛋白）及少量酸性蛋白，細(xì)胞質(zhì)中主要有酸性蛋白，標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理抽提掉核酸后，用不同pH值的快綠染液分別染色，可使細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白顯示出來。2.實驗方法 制備蟾蜍血涂片（如右圖）。（1）固定：70%乙醇，10min；（2）抽提核酸：70 905%三氯醋酸， 1520min;（3）在冷5三氯醋酸溶液漂洗后， 蒸餾水洗3次，每次5min；（4）染色:酸性蛋白染色液1015min, 堿性蛋白染色液3060min;（5）清水沖洗，晾干; （6）鏡檢。（三）堿性蛋白和酸性蛋白的顯示 3.結(jié)果分析 右圖顯示的是在低倍鏡和

36、油鏡下細(xì)胞內(nèi)堿性蛋白質(zhì)分布圖： 核被染成綠色就是堿性蛋白所在部位。(三）堿性蛋白和酸性蛋白的顯示 低倍鏡油鏡蟾蜍血涂片顯示細(xì)胞核內(nèi)堿性蛋白 右圖顯示： 在高倍鏡下細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)遍布綠色，是酸性蛋白所在部位，細(xì)胞核內(nèi)綠色稀少。（三）堿性蛋白和酸性蛋白的顯示 蟾蜍血涂片顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性蛋白（四）DNA和RNA的顯示 1.實驗原理 利用堿性染料甲基綠和派洛寧處理細(xì)胞，可使其中的DNA和RNA呈現(xiàn)出不同的顏色，這種顏色上的差異是由DNA和RNA聚合程度的不同所引起。 甲基綠 DNA聚合程度高 綠色 派洛寧 RNA聚合程度低 紅色 制備蟾蜍血涂片：同上； 固定：95%乙醇，10min，晾干； 染色：甲基綠-

37、派洛寧，10min； 清水沖洗，并用吸水紙吸去玻片上多余的水 分，但不要吸得過干； 分化：將血涂片在純丙酮中迅速地過一下，進(jìn) 行分化，取出晾干； 鏡檢。2.實驗方法（四）DNA和RNA的顯示 3.結(jié)果（四） DNA和RNA的顯示 右圖顯示： 在低倍鏡下細(xì)胞核內(nèi)遍布綠色，是DNA所在部位，稀少粉色是RNA。 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)遍布粉色，是RNA所在部位。蟾蜍血涂片顯示核酸分布（五）過氧化氫酶的顯示 1.實驗原理 酶是活細(xì)胞中具有催化功能的一類生物催化劑。在顯示細(xì)胞中的酶時，往往利用反應(yīng)產(chǎn)物本身的顏色或與某些試劑作用后出現(xiàn)的特殊顏色反應(yīng)，從而間接地將相應(yīng)的酶在細(xì)胞中的分布顯示出來。2H2O2 2H2O+O

38、2過氧化氫酶聯(lián)苯胺 聯(lián)苯胺藍(lán) 聯(lián)苯胺腙 （藍(lán)色） （棕色） 細(xì)胞代謝過程中會產(chǎn)生H2O2，細(xì)胞中的過氧化氫酶，能使H2O2分解，生成H2O放出O2。 過氧化氫酶系還能把許多胺類物質(zhì)氧化為有色化合物： 因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來判定細(xì)胞中過氧化氫酶的有無或多少?。ㄎ澹┻^氧化氫酶的顯示 2.實驗方法處死動物：用氣栓法將家兔處死；取材和制片：取股骨，制備骨髓涂片，晾干；固定：將涂片放入0.5%硫酸銅溶液中固定3060s；（五）過氧化氫酶的顯示 氧化：取出涂片直接轉(zhuǎn)入裝有聯(lián)苯胺混合液的染色缸中36min；沖洗：自來水沖洗；染色：滴23滴1%番紅溶液于涂片上,染色12min；沖洗：自來水沖洗,晾干；觀察。（

39、五）過氧化氫酶的顯示 3.結(jié)果 細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒即為過氧化氫酶所在部位（五）過氧化氫酶的顯示 四、實驗報告 1.繪圖描述細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶和酸性磷酸酶、 堿性蛋白和酸性蛋白、過氧化氫酶 陽性結(jié) 果圖。 2. 繪圖描述細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的分布。實驗五細(xì)胞組分的分離與鑒定一、實驗?zāi)康呐c要求1.掌握差速離心法分離細(xì)胞器的原理。2.掌握離心機(jī)和勻漿器的使用方法。二、實驗材料和用品 1.實驗材料：小白鼠、冰塊。 2.儀器設(shè)備與用品：玻璃勻漿器、普通離心機(jī)、臺式高速 離心機(jī)、普通天平、光學(xué)顯微鏡、載 玻片、蓋玻片、刻度離心管、高速離 心管、滴管、10ml量筒、25ml燒杯、 玻璃漏斗、解剖剪、鑷子、吸水紙、

40、 紗布、螬盤、平皿。 3.藥品與試劑：0.25molL蔗糖0.003molL氯化鈣溶 液、1甲苯胺蘭染液、0.02詹納斯綠B 染液、0.9NaCl溶液。三、實驗內(nèi)容1.實驗原理2.實驗方法3.實驗結(jié)果與分析4.注意事項（一）實驗原理細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理,常用不同轉(zhuǎn)速的離心法,將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿,在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離,其過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級分離和分析三步。勻漿離心細(xì)胞核線粒體等離心（二）差速離心法-分離細(xì)胞核和線粒體細(xì)胞核的分離提取用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，

41、迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊（去除結(jié)締組織）盡快置于盛有0.9NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25molL蔗糖0.003molL氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后,再全部加入。細(xì)胞核的分離提取3. 剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨35次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中。4. 將裝有濾液的離心管配平后,放入離心機(jī),以2500r/min，4離心15分鐘；緩緩取上清液，移入高速離心管，保存于有冰塊的燒杯中，余下的

42、沉淀物進(jìn)行下一步驟。細(xì)胞核的分離提取5. 用6ml 0.25mol/L蔗糖-0.003molL氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500r/min離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，自然干燥。6. 將涂片用l甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。高速離心分離提取線粒體將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000r/m離心20分鐘，棄上清，留取沉淀物。加入0.25molL蔗糖0.003molL氯化鈣液lml,用吸管吹打成懸液，以17000r/m離心20分鐘,將上清吸入另一試管中,留取沉淀物,加入0.1ml 0.25molL蔗糖-0.003molL氯化鈣溶

43、液混勻成懸液。取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上,各滴一滴0.02詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20分鐘。（三）實驗結(jié)果與分析細(xì)胞核:在高倍鏡下觀察涂片,體積較大、形狀規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整的球形細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞核旁邊的部分細(xì)胞碎片亦被染成藍(lán)色。（注意觀察視野中所見的細(xì)胞核的數(shù)量、細(xì)胞核是否完整以及細(xì)胞碎片的多少等）。線粒體：在高倍鏡下觀察涂片,桿狀、粒狀的線粒體被染成亮綠色。（注意觀察視野中所見的線粒體的數(shù)量、線粒體是否完整以及細(xì)胞碎片的多少等）。（四）注意事項動物實驗前可空腹過夜,以降低肝臟組織中的脂肪量。盡可能充分剪碎肝組織,縮短勻漿時間,整個過程最好在04或冰浴中進(jìn)行。實驗中注意保

44、持細(xì)胞器的完整性，避免劇烈的機(jī)械操作。由于核沉淀中可能依然存在大量因為粘連或纏繞而沉淀的線粒體,所以可酌情將步驟(5)中洗滌核沉淀后離心得到的上清，與步驟（4）的上清合并加以利用。由于線粒體進(jìn)行活性染色法的檢測，所以樣品制備好后應(yīng)盡快染色，不要放置過久。四、實驗報告 1. 將分離到細(xì)胞器（線粒體、細(xì)胞核）繪圖描述顯微鏡下所見結(jié)果。 2. 估計分離所得的細(xì)胞和線粒體的純度。 3. 根據(jù)你的體會，寫出操作注意事項及改進(jìn)方法。實驗六細(xì)胞生理功能性實驗一、目的與要求（一）觀察巨噬細(xì)胞的吞噬活動。（二）掌握小鼠腹腔注射給藥和脫頸椎處死方法。（三）掌握死活細(xì)胞鑒別的原理及方法。（四）通過觀察加深理解細(xì)胞膜

45、的通透性的生理 活動。 二、實驗器材和試劑 1. 材料： 小白鼠、酵母懸液。 2. 儀器與用品： 普通離心機(jī)、試管、試管架、光學(xué)顯微鏡、 2ml 注射器、載玻片、蓋玻片、解剖器材、滴管等。 3.試劑： 0.15mol/L NaCl溶液、0.005 mol/L NaCl溶液、氯仿、 0.8mol/L甲醇溶液、0.8 mol/L丙三醇溶液、 2%TritonX-100、肝素抗凝劑（500U/ml）、l 雞血懸液、6淀粉肉湯、0.3臺盼蘭、酵母懸液 0.2亞甲基藍(lán)染液等。 三、實驗內(nèi)容（一）細(xì)胞吞噬活動觀察（二）活細(xì)胞和死細(xì)胞的鑒定（三）細(xì)胞膜的通透性觀察（一）細(xì)胞吞噬活動觀察 1.實驗原理 白細(xì)胞

46、是機(jī)體防御系統(tǒng)中能游走的單位。它分 為粒細(xì)胞系、單核細(xì)胞系、淋巴系三類。單核 細(xì)胞由血液進(jìn)入組織后逐漸演變成巨噬細(xì)胞。 吞噬細(xì)胞首先由于趨化作用而向異物游走,然 后伸出偽足包圍異物,并發(fā)生內(nèi)吞作用形成吞 噬泡將異物吞入細(xì)胞,繼而溶酶體與吞噬泡融 合消化異物。2. 實驗方法 實驗前2天，每天向小鼠 腹腔注射6淀粉肉湯 0.51ml(含0.3臺盼 蘭); 實驗時，每組取一只經(jīng)上 述處理的小鼠，腹腔注射 1雞血懸液0.51ml， 注射后輕揉小鼠腹部以使 紅細(xì)胞懸液分散均勻;（一）細(xì)胞吞噬活動觀察示小鼠腹腔注射方法 1小時后，用頸椎脫位法 處死小鼠，迅速剖開小鼠 腹壁，向腹腔注0.5ml 1ml生理鹽

47、水，用牙簽輕 輕攪拌使生理鹽水與腹腔 液混勻; 用注射器抽取腹腔液，滴 片，然后蓋上蓋片; 鏡檢。（一）細(xì)胞吞噬活動觀察頸椎脫位法3. 實驗結(jié)果與分析 在高倍鏡下，數(shù)量較多、體積較大、圓型或不規(guī)則的細(xì)胞，其表面有許多似刺狀的小突起，胞質(zhì)中有許多數(shù)量不等的藍(lán)色顆粒（為吞入的含臺盼藍(lán)淀粉肉湯形成的吞噬泡）即為吞噬細(xì)胞。（一）細(xì)胞吞噬活動觀察（一）細(xì)胞吞噬活動觀察高倍鏡下顯示吞噬細(xì)胞（吞入了臺盼藍(lán)淀粉肉湯形成的吞噬泡的吞噬細(xì)胞）（一）細(xì)胞吞噬活動觀察 箭頭所示正在吞噬肉湯的細(xì)胞(二)細(xì)胞活性的鑒定酵母菌 1. 實驗原理 許多染料不易穿過活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細(xì)胞內(nèi)，使其著色，以此來鑒

48、別死活細(xì)胞。2. 實驗方法 取酵母懸液一滴于潔凈玻片上，滴一滴 0.2亞甲基藍(lán)染液，加蓋片，2分鐘后于 顯微鏡下觀察細(xì)胞。(二)細(xì)胞活性的鑒定酵母菌3. 實驗結(jié)果顯微鏡下可見死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。(二)細(xì)胞活性的鑒定酵母菌（三）細(xì)胞膜的通透性 1實驗原理 細(xì)胞膜是一種半透膜，可選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì) 胞。將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲 到細(xì)胞內(nèi)，可使細(xì)胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì) 中，由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅 蛋白溶液，這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細(xì)胞放在某 些等滲鹽溶液中，由于紅細(xì)胞膜對各種溶質(zhì)的通 透性不同，膜兩側(cè)的滲透壓平衡會發(fā)生改變，也 會發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此，發(fā)生

49、溶血現(xiàn)象所需時間 長短可作為測量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。2實驗方法 (1) 取小鼠血液1ml，用0.15mol/L NaCl溶液9ml洗滌3 次（每次洗后需1000r/min離心5min），最后配成 50%的紅細(xì)胞懸液。 (2) 取6支試管，分別加入0.15mol/L NaCl溶液、0.005 mol/L NaCl溶液、0.8 mol/L甲醇溶液、0.8 mol/L 丙三醇溶液、氯仿、2% TritonX-100各3ml，作出標(biāo) 記后，各管均加入紅細(xì)胞懸液2滴，混勻后靜置于溫 室中，觀察各支試管中發(fā)生溶血的時間及其變化。（三）細(xì)胞膜的通透性3實驗結(jié)果與分析 (1)試管內(nèi)液體分上下兩層：上

50、層淺黃色透明，下層紅 色不透明為不溶血，鏡檢紅細(xì)胞完好呈雙凹盤狀。 (2)如果試管內(nèi)液體渾濁，上層帶紅色者，稱不完全溶 血，鏡檢有部分紅細(xì)胞呈碎片。 (3)如果試管內(nèi)液體變紅而透明者，稱完全溶血，鏡檢 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部呈碎片。 （三）細(xì)胞膜的通透性四、實驗報告1.繪制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的過程圖。2.記錄小鼠紅細(xì)胞在不同溶液中的形態(tài)變化 并對結(jié)果進(jìn)行分析。 細(xì)胞分裂標(biāo)本制備及觀察實驗七前言 細(xì)胞增殖是生命的基本特征之一，生命能夠不斷的延續(xù)，最重要的基礎(chǔ)就是依靠細(xì)胞的生長和增殖。細(xì)胞增殖是通過分裂過程實現(xiàn)的。細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài)，任何動植物組織可通過各種處理方法后，細(xì)胞可以進(jìn)入分裂期，就可用于染

51、色體分析。細(xì)胞增殖分裂可分為無絲分裂、有絲分裂和減數(shù)分裂。本實驗主要介紹動植物細(xì)胞的有絲分裂標(biāo)本制備方法和各期形態(tài)特征；動物細(xì)胞減數(shù)分裂標(biāo)本制備方法、各期形態(tài)特征及其觀察要點(diǎn)。一、目的與要求（一）初步掌握動物細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂標(biāo) 本的制備方法。（二）掌握動物細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂各期的 主要形態(tài)特征和區(qū)別點(diǎn)。二、實驗材料和用品1. 材料： 洋蔥根尖縱切片標(biāo)本、馬蛔蟲子宮切片標(biāo)本； 性成熟雄性小白鼠。2. 儀器與用品： 光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)箱、CO2孵箱、水浴箱、離 心機(jī)、解剖盤、解剖刀、鑷子、剪刀、注射器、 吸管、刻度離心管、小燒杯、培養(yǎng)皿、載玻片3.試劑： 100g /ml（0.1%）秋水仙

52、素、1mol/L鹽酸、2% 檸檬酸鈉、0.075mol/L氯化鉀溶液、Garnoy固定 液、1/15mol/L磷酸鹽緩沖液、60%乙酸、 500g/ml（0.5%）甲苯胺藍(lán)染液、改良堿性品 紅染液、10%Giemsa染液等。三、實驗內(nèi)容（一）動物細(xì)胞有絲分裂觀察（馬蛔蟲卵切片）（二）植物細(xì)胞有絲分裂觀察（洋蔥根尖壓片）（三）植物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本的制備及觀察（四）小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備及觀察（五）小鼠精巢細(xì)胞減數(shù)分裂標(biāo)本制備及觀察（一）動物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本觀察 1.實驗原理 有絲分裂是真核細(xì)胞分裂的主要方式之一，在分裂的過程中發(fā)生了一系列的形態(tài)變化，包括核分裂、染色體和紡錐體的出現(xiàn)，染色體

53、平均分配到兩個子細(xì)胞等。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，人為地將有絲分裂分為前期、中期、后期和末期。植物根尖細(xì)胞、動物卵細(xì)胞等分裂旺盛的細(xì)胞，經(jīng)固定染色制成光鏡壓片或切片，可以觀察到有絲分裂過程中各時期的形態(tài)特征及變化規(guī)律。1.馬蛔蟲受精卵子宮切片觀察 將馬蛔蟲子宮切片放在低倍鏡下觀察，可見子宮周邊為子宮壁，壁內(nèi)為子宮腔，腔內(nèi)有許多處于不同發(fā)育階段的圓形卵細(xì)胞。（一）動物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本觀察低倍鏡下馬蛔蟲子宮切片圖像 高倍鏡下可見馬回蟲子宮腔內(nèi)大量受精卵處于有絲分裂的各個時期的形態(tài)特征。（一）動物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本觀察高倍鏡下馬蛔蟲子宮腔內(nèi) 各個分裂期的受精卵 馬蛔蟲受精卵最外層有較厚而染色極深的受精膜（亦稱卵

54、殼），在受精膜內(nèi)側(cè)和受精卵邊緣，各有一深染小體，分別稱為第一極體和第二極體。受精膜內(nèi)有圍卵腔，受精卵細(xì)胞在圍卵腔內(nèi)分裂。（一）動物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本觀察卵殼受精卵細(xì)胞卵膜圍卵腔高倍鏡下馬蛔蟲受精卵形態(tài)特征示意圖有絲分裂中期和后期的受精卵示中心體和極體第一極體第二極體中心體 右圖是尚未分裂的受精卵，有兩個核，一個雌原核和一個雄原核，核內(nèi)含細(xì)絲狀染色質(zhì)。（一）動物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本觀察馬蛔蟲受精卵示雌、雄原核馬蛔蟲受精卵子宮切片中有絲分裂各期形態(tài)特征 前期： 核膨大，中心粒分開逐漸向細(xì)胞的兩極移動，中心粒周圍有呈放射狀的星射線。染色質(zhì)縮短變粗形成染色體，核膜核仁消失，紡錐體開始形成。（一）動物細(xì)胞有絲

55、分裂標(biāo)本觀察高倍鏡下示前期分裂相中期： 核膜完全消失，兩極有中心體，中心體周圍的星射線明顯可見，染色體排列在赤道板上，且每條染色體分為兩條染色單體。染色體數(shù)目為6條，光鏡下清晰可數(shù)。（一）動物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本觀察高倍鏡下示中期分裂相馬蛔蟲受精卵子宮切片中有絲分裂各期形態(tài)特征 中期(側(cè)面觀)中心粒 中期(側(cè)面觀)后期： 染色體著絲?？v裂，在紡錘絲的牽引下向細(xì)胞兩極移動，兩組染色體間仍可見紡錘絲。星射線也可觀察到。（一）動物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本觀察高倍鏡下示后期分裂相馬蛔蟲受精卵子宮切片中有絲分裂各期形態(tài)特征末期： 兩組染色體到達(dá)兩極并逐漸解旋為染色質(zhì).核膜、核仁重新出現(xiàn)。紡錘體和星射線消失。細(xì)胞中央

56、處膜向內(nèi)凹陷，逐漸加深，最后縊縮成兩個子細(xì)胞。 （一）動物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本觀察高倍鏡下示后期分裂相馬蛔蟲受精卵子宮切片中有絲分裂各期形態(tài)特征(二）植物細(xì)胞有絲分裂的標(biāo)本觀察 取洋蔥根尖壓片或洋蔥根尖切片標(biāo)本于低倍鏡下觀察，找到根尖分生區(qū)，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察分裂各期的特征及變化規(guī)律洋蔥根尖各部結(jié)構(gòu)圖及其有絲分裂過程模式圖(二）植物細(xì)胞有絲分裂的標(biāo)本觀察 前期： 早前期核膨大，核內(nèi)充滿染色質(zhì)，染色質(zhì)呈細(xì)絲狀盤曲成網(wǎng)狀。隨著分裂的進(jìn)行，染色質(zhì)逐漸縮短變粗，到晚前期染色質(zhì)凝集成染色體，核仁解體核膜消失，紡錐體形成。 植物細(xì)胞有絲分裂各期形態(tài)模式圖 前期 中期后期 末期植物細(xì)胞有絲分裂各期形態(tài)特征(二）植

57、物細(xì)胞有絲分裂的標(biāo)本觀察 中期：染色體形態(tài)、數(shù)目清楚（2n = 16），染色體 最大限度凝集,排列在細(xì)胞的中央赤道板上， 有絲分裂器完全形成。后期：每條染色體的著絲?？v裂，使兩條染色單體 分開并在紡錐絲的牽引下向細(xì)胞的兩極移動末期：染色體到達(dá)細(xì)胞兩極并開始解旋去凝集，逐 漸伸長變細(xì)，恢復(fù)為染色質(zhì)的狀態(tài)。核仁、 核膜重新出現(xiàn)，形成兩個新的細(xì)胞核，在細(xì) 胞板處分裂成兩個子細(xì)胞。植物細(xì)胞有絲分裂各期形態(tài)特征（三）植物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本制備及觀察 1.實驗原理 有絲分裂是體細(xì)胞分裂的主要方式，一般發(fā)生在植物根尖或莖尖的分生組織中。在有絲分裂時，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)有很大的變化，但以細(xì)胞核內(nèi)染色體的變化最為明顯

58、，而且是有規(guī)律地進(jìn)行。洋蔥體細(xì)胞中有8對共16條染色體，在有絲分裂過程中，每個染色體能復(fù)制一份，然后分配到兩個子細(xì)胞中，所以兩個子細(xì)胞與母細(xì)胞所含的染色體在數(shù)目、形態(tài)和性質(zhì)上都是相同的。在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，人們常常需要了解某一物種的染色體數(shù)目，而最有效的方法就是觀察細(xì)胞有絲分裂的中期，這樣能得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。 （三）植物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本制備及觀察 1.實驗方法 （1）取材：將去掉老根的洋蔥鱗莖放在盛滿清水的小燒杯里，于25培養(yǎng)箱或25室溫培養(yǎng)34天.（2）預(yù)處理：剪下約0.5cm長的根尖，將切下的根尖放入0.1%的秋水仙素溶液中，室溫24h。洋蔥鱗莖（三）植物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本制備及觀察 （3

59、）固定、水解、漂洗、染色： 放入Carnoy固定液中固定1030min；再將根尖用清水沖洗后放入盛有少量1mol/L鹽酸的培養(yǎng)皿中，置60恒溫水浴箱解離10min左右，然后在蒸餾水中漂洗變軟的根尖約30min，鑷子夾取至潔凈的載玻片上，吸去多余的水分；滴加0.5%甲苯胺藍(lán)或改良堿性品紅染液12滴，蓋上蓋玻片，用鑷子柄平放輕壓有根尖的部位，見根尖壓扁鋪開后置顯微鏡下觀察。（三）植物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本制備及觀察 3.結(jié)果分析 (1) 在低倍鏡下找到分生區(qū)細(xì)胞。 分生區(qū)細(xì)胞特點(diǎn)是：細(xì)胞呈正 方形，排列緊密，有的細(xì)胞正 處于分裂期。 (2) 在高倍鏡下可見處于細(xì)胞分裂 各期的分裂相：如右圖為甲苯 胺藍(lán)染

60、色的洋蔥根尖標(biāo)本，找 出前期、中期、后期、末期的 細(xì)胞。 洋蔥根尖壓片標(biāo)本示植物細(xì)胞有絲分裂過程圖 末期前期中期后期植物細(xì)胞有絲分裂過程形態(tài)圖（三）植物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本制備及觀察 3.注意事項（1）剪取洋蔥根尖材料時，應(yīng)該在洋蔥根尖 細(xì)胞一天之中分裂最活躍的時間； （2）解離時，要將根尖細(xì)胞殺死，細(xì)胞間質(zhì) 被溶解，使細(xì)胞容易分離； （3）壓片時，用力的大小要適當(dāng)，要使根尖 被壓平，細(xì)胞分散開。1.實驗原理 在細(xì)胞有絲分裂過程中，有絲分裂中期的染色體呈高度螺旋化，有利于觀察染色體的形態(tài)特征。在正常動物體內(nèi)，骨髓是處于不斷分裂的組織之一，其分裂指數(shù)較高，制片后可直接得到較多的分裂中期染色體。為了得