08制藥環(huán)境分離微生物的鑒定技術(shù)應(yīng)用-余萌

1、制藥環(huán)境分離微生物的鑒定技術(shù)應(yīng)用中檢院微生物檢測室2019.4.26中國食品藥品檢定研究院Nation Institutes for Food and Drug Control主要內(nèi)容制藥環(huán)境微生物微生物分離鑒定技術(shù)鑒定技術(shù)應(yīng)用National Institutes for Food and Drug Control1.制藥環(huán)境微生物Clean Room: A room in which he concentration of airborne particles is controlled to meet aspecified airborne particulate cleanliness

2、 Class. In addition, the concentration ofmicroorganisms in the nvironment is monitored; each cleanliness Class defined is alsoassigned a icrobial level for air, surface, and personnel gear.(USP1116)CleanroomRABSIsolatorNational Institutes for Food and Drug Control1.制藥環(huán)境微生物設(shè)備空氣Controlled e vironmen s

3、：air,surface, personnel gear制藥環(huán)境人員水系統(tǒng)National Institutes for Food and Drug Control1.制藥環(huán)境微生物National Institutes for Food and Drug Control1.制藥環(huán)境微生物 空氣： 主動(dòng)空氣采樣:采樣器 被動(dòng)空氣采樣：沉降板 表面： 接觸碟 拭子 表面沖洗 人員Drug Control關(guān)注環(huán)境微生物的意義微生物分布特點(diǎn)、遷移規(guī)律0102人員培訓(xùn)、操作清潔消毒程序0304反映生產(chǎn)環(huán)境是否處于充分受控的狀態(tài)DocumentRecommendationEC guide to GMP,

4、 Revision of Annex 1, Manufacture of SterileMedicinal ProductsIf microorganisms are detected in a grade A or B zone, they should be identified tospecies level and the impact of such microorganisms on product quality (for each batchimplicated) and state of control should be evaluated. Consideration m

5、ay also be given tothe identification of grade C and D contaminants and the requirements should be definedin the contamination control strategy.FDA Guidance for Industry- Sterile Drug Products Produced byAseptic Processing-Current Good Manufact ring PracticeMonitoring critical and immediately surrou

6、nding clean areas as well as personnelshould include routine identification of microorganisms to the species (or, whereapp opriate, genus) level.t minimum, the program should require species (or, where appropriate, genus)identification of microorganisms in these ancillary environments at frequent in

7、tervals toestablish a valid, current database of contaminants present in the facility during processing(and to demonstrate that cleaning and sanitization procedures continue to be effective).Pharmaceutical Inspection Co-cooperation Scheme(PICS)-Recommendation on sterility TestingRoutine identificati

8、on of environmental microorganisms to at least the genuslevel should assist in detecting trends.FDA Guide to Inspections of microbiology Pharm ceuticalQuality Control LaboratoriesThe importance of identifyin all isolates from either or both otal Plate Count testing andenrichment testing will depend

9、upon the product and its intended use. Obviously, if anoral solid dosage form such as a tablet is tested, it may be acceptable to identify isolateswhen testing shows high levels. However, for other products such as topicals, inhalants ornasal solutions w ere there is a major concern for microbiologi

10、cal contamination, isolatesfrom plate counts, as well as enrichment te ing, should be identified.PDA TECHNICAL REPORT NO. 13Characteriz tion of Isolates:Characterizing microorganisms recovered from environmentalRevised Fundamentals of an Environmental Monitoring programandonnel monitoring is an impo

11、rtant part of surveillance programs.DocumentRecommendationUSP , ChP, EP , JP 結(jié)果判斷：對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行鑒定并調(diào)查，排除實(shí)驗(yàn)污染無菌檢查法USP , ChP, EP , JP 其他檢出的潛在危害微生物評(píng)估非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：標(biāo)準(zhǔn)USP , ChP, EP , JP 疑似菌確認(rèn)非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查USP微生物控制和無菌過程環(huán) 監(jiān)控IDENTIFICATION OF MICROBIAL ISOLATES：A successful environmental control program include

12、san appropriate level f identification of the flora obtained by sampling. A knowledge of the flora incontrolled environments aids in determining the usual microbial flora anticipated for the facility and inevaluating the effectiveness of the cleaning and sanitization procedures, methods, agents, and

13、 recoverymeth ds. The information gathered by an identification program c n be useful in the investigation of thesource o contamination, especi lly when recommended detectio frequencies are exceeded.Identif cation of isolates from critical and immediately adjacent areas should take precedence overen

14、tification of microorganisms from noncritical areas. Identification methods should be verified, andready-to-use kits should be qualified for their intended purpose.USP制藥用水In addition to the e um ration of the bioburden in the water, there is a need to identify and/or select certainm robial species t

15、h could be detrimental to pro ucts or processes.The efore, it is ndustry practice to identify the microorganisms in samples that yield results exceedingestablished Alert and Action Levels. It is also of value to periodically identify the normal microbiome in awaterm, even if counts are below establi

16、shed Alert Levels.USP非無菌產(chǎn)品微生物載荷控制In most nonsterile hygienic assessments, characterization of he microorganisms, cellular morphology,G m reaction, a simple diagnostic testing are sufficient.USP,EP, JP生物指示劑Where identification of the BI species is deemed necessary, as in the course of an investigatio

17、n into unusualresults, use either aypic or genotypic identification method (see Microbial Characterization,Identification, and Stra Typing for additio al information).1.制藥環(huán)境微生物微生物鑒定應(yīng)用于藥品生產(chǎn)的各個(gè)過程中，扮演著工具的角色，通常FDA鮮有單獨(dú)針對(duì)微生物鑒定的警告信。 對(duì)于非無菌產(chǎn)品未按照21 CFR 211.113（a）中要求建立并遵循控制不可接受微生物的程序。如：環(huán)境監(jiān)控記錄中在產(chǎn)品接觸表面檢出革蘭氏陰性細(xì)菌，

18、但企業(yè)并未對(duì)其進(jìn)行鑒定以判斷其是否不可接受微生物。 對(duì)于非無菌產(chǎn)品未按照21 CFR 211.113（a）中要求建立并遵循控制不可接受微生物的程序。如：沒有對(duì)空氣樣品分離微生物的鑒定記錄。 缺少對(duì)于微生物污染原因充足的調(diào)查證據(jù)，也未在每次測試期間保持完整的記錄。如：企業(yè)對(duì)于483警告信的回復(fù)中申訴：對(duì)預(yù)糊化淀粉中分離出的一株微生物進(jìn)行了鑒定，但FDA并未找到能夠證 這次鑒定的證據(jù)。 對(duì)于無菌產(chǎn)品未按照21 CF 211.113 b）中的要求建立并遵循防止微生物污染的程序。如：FDA建議企業(yè)提供委托獨(dú)立第三方分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的鑒定和分型結(jié)果。National Institutes for Food

19、 and Drug Control1.制藥環(huán)境微生物食品 低營養(yǎng)、低水分 防腐劑、消毒劑、殺菌劑 非適宜生長環(huán)境臨床藥品 生長代謝緩慢 與外界的物質(zhì)交換不活躍 表型特征不典型（形態(tài)、生理生化）微生物生長繁 條件逐漸嚴(yán)苛National Institutes for Food and Drug Control1.制藥環(huán)境微生物設(shè)備空氣 Pseudomonas spp.假單胞菌（潮濕含水表面） Staphylococcus epidermidis 表葡 Bacillus spp. 芽孢桿菌 Micrococcus spp.微球菌 Bacillus spp. 芽孢桿 Staphylococcus s

20、pp. 球菌 Corynebacterium s p. 棒狀桿菌 Aspergillus spp. 曲霉 Cladosporium spp. 枝孢屬，Stachybotrys spp. 葡萄穗霉屬,and Aureobasidium pullulans出芽短梗霉屬 Aspergillusspp.曲霉, Penicillium spp. 青霉制藥環(huán)境 Penicillium spp. 青霉人員 Staphylococcus spp.葡萄球菌 Micrococcus spp.微球菌 Acinetobacter spp.不動(dòng)桿菌 Alcaligenes spp. 產(chǎn)堿桿菌 Pseudomonas s

21、pp.假單胞菌 Alcaligenes .產(chǎn)堿桿菌屬水系統(tǒng) Stenotrophom s spp.寡養(yǎng)單胞菌 Burkhold ia cepaci 洋蔥伯克霍爾德菌 Burkhol eria picketti 皮氏伯克霍爾德菌 Methylobacterium 甲基桿菌屬 Serratia spp.沙雷氏菌 Lipophilic yeasts 親脂性酵母菌 Der atophyte fungi 皮膚真菌National Institutes for Food and Drug Control Flavobacterium spp.黃桿菌1.制藥環(huán)境微生物第三方檢測實(shí)驗(yàn)室對(duì)收集到的微生物進(jìn)行鑒定

22、，結(jié)果類群統(tǒng)計(jì)，出現(xiàn)頻率大于1%的15個(gè)種占到超過50%的比例。Gram-positive coccus: 31.4%Gram-positive, spore-forming rod: 13.3%Pleomorphic Gram-positive rod: 3.7%Gram negative rod: 1.7%National Institutes for Food and Drug Control1.制藥環(huán)境微生物23.70%28.80%4.30%5.80%19.40%6.50%11.50%葡萄球球菌屬 微球菌屬 芽孢桿菌屬 微桿菌屬 不動(dòng)桿菌屬 假單胞菌屬 其他nal Institutes

23、 for Food and Drug Control主要內(nèi)容制藥環(huán)境微生物微生物分離鑒定技術(shù)鑒定技術(shù)應(yīng)用National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)比較:與微生物鑒定系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)參考微生物（模式菌株、標(biāo)準(zhǔn)菌株或經(jīng)過確認(rèn)的菌株等）的特征（基因型和/或表型）相匹配。QUERYDATABASENational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù) 微生物鑒定：指借助現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，通過對(duì)未知微生物的特征測定，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌、酵母菌和霉菌大類的區(qū)分，或?qū)佟⒎N及菌株水平確定的過程。

24、（ChP 9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則） Microbial identification: The determination of which broad group(e.g., bacteri yeast, or mold) or narrow group (e.g., genus and/orspecies) to which a laboratory isolate belongs.（USP 1113）National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)分類依據(jù) 鑒定依據(jù)Polyphasic taxonomy：1970年Co

25、lwel 提出將所有可以獲得的表型、基因型和化學(xué)信息整合在一起，建立普遍適用于 有細(xì)菌的分類方案。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)1969年，美國科學(xué)家R.H.Whittaker在原有的四界基礎(chǔ)上，提出“五界學(xué)說”，被廣泛接受。界1977年Carl W se對(duì)大量微生物的16S及18S rRNA進(jìn)行測序并比較同源性，提出“三域?qū)W說”。域2.微生物分離鑒定技術(shù)-Phylum/Division 門-Domain 域-Kingdom 界Eury rchaeotaCrena chaeota古細(xì)菌真細(xì)菌變形菌門厚壁菌門放線菌

26、門原核生物域原生生物真菌真菌在各個(gè)分類層級(jí)之間增加了亞單位來進(jìn)一步完善分類。真核生物域植物霉菌和酵母不是分類學(xué)上的名稱動(dòng)物National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)大腸埃希菌（Escherichia coli）如何得知微生物的分類學(xué)信息？-Domain 域-Kingdom 界-Phylum/Divisio 門-Class 綱-原核生物-真細(xì)菌-變形菌門-變形菌綱-腸桿菌目-腸桿菌科-埃希菌屬 細(xì)菌、真菌的分類數(shù)據(jù)庫 權(quán)威的分類學(xué)鑒定專著-Order 目-Family 科-Genus 屬-Species 種-大腸埃希菌Nati

27、onal Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù) 鑒定水平：視情況a 大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，落形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)，革蘭氏染色及關(guān)鍵生化反應(yīng)；b 非無菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應(yīng)達(dá)到種屬藥典規(guī)定水平；c) 無菌試驗(yàn)結(jié)果陽性和、無菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗、環(huán)境嚴(yán)重異常事件時(shí)，對(duì)檢出的微生物鑒定至少達(dá)到種屬水平，必要時(shí)需達(dá)到菌株水平。（ChP 9204）National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù) 微生物鑒定：指借助現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，通過對(duì)未知

28、微生物的特征測定，對(duì)其進(jìn)行大類的區(qū)分，或 及 水平確定的過程。（ChP 9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則）生化組分基因基因分型菌落觀察鏡檢National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)初篩試驗(yàn)初步確定待檢微生物基本特征；進(jìn)行大類的區(qū)分，為后續(xù)鑒定方法的選擇提供方向表型鑒定通過各種手段對(duì)待檢微生物的生理生化、化學(xué)成分、能源利用、抗逆性等特征進(jìn)行鑒別獲得準(zhǔn)確鑒定結(jié)果的 提基因型鑒定基于基因水平 鑒定手段，基因型相對(duì)受外界環(huán)境影響小，與微生物生長代謝活性關(guān)聯(lián)較弱National Institutes for Food and Drug C

29、ontrol2.微生物分離鑒定技術(shù) 分離純化：挑取待檢菌株在適宜的培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，以獲取純培養(yǎng)物（單菌落）。從藥物原材料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)品中檢出的受損微生物，應(yīng)在適宜條件下多次傳代以恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù) 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基性狀：液體（定性）、固體（觀察鑒定）、半定量（運(yùn)動(dòng)） 培養(yǎng)基營養(yǎng)：水、碳源、能源、氮源、礦物質(zhì)、生長因子、PH 培養(yǎng)基種 選擇性、指示性 溫度 嗜溫：20-45 嗜熱：50+ 嗜冷：15-National Institutes for Food and

30、Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù) 形態(tài)觀察 顏色：白、奶油、紅、綠、棕、黃 形狀：圓、圓 邊緣鋸齒、擴(kuò)散、絲狀 表面：光滑、完整、 浪、分支、葉狀、模糊 高度：扁平、凸起、水滴 、火山口狀、不規(guī)則National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)2.微生物分離鑒定技術(shù)鏈格孢屬籃狀菌屬鐮孢菌屬National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)染色、鏡檢表型鑒定生化組分鑒定技術(shù)序列分析基因型鑒定 核糖體分型PFGE、WGSNational Institutes

31、for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)表 中藥飲片污染微生物數(shù)據(jù)庫構(gòu)建使用鑒定方法統(tǒng)計(jì)鑒定單位 數(shù)量（株）鑒定方法中檢院四川66534316S RNAMALDI-TOF MSMALDI-TOF MS，API，VITEK，16SrRNA廣西283浙江陜西1818773MALDI-TOF M ，16S rRNAVITEK，BIOLOVITEK，API河北黑龍江上海31264VITEKVITEK，16S rRNAVI EK遼寧合計(jì)1693/National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù) Microbi

32、al characteriza ion: The use of colony growth, celluar morphology, differentstaining, and key diagnos ic features to characterize a laboratory isolate for trendingand investigative purposes without identification, e.g., nonpathogenic Staphylococci. 初篩試驗(yàn)a) 培養(yǎng)物特征b) 染色鏡檢（或氫氧化鉀拉絲試驗(yàn)c) 重要生化試驗(yàn)National Inst

33、itutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)革蘭氏染色法：1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram 芽胞染色法：芽胞壁結(jié)構(gòu)致密，通透性低，不所創(chuàng)立，用于區(qū)分革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰 易著色，在革蘭氏染色中呈透明狀。難著色，性細(xì)菌。難脫色。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)1min1min10-20sa) 操作b) 對(duì)照c) 菌齡1minG-G+芽胞染色National Institutes for Food and Drug Control革蘭氏染色2.微生物分離鑒定技術(shù) 什么時(shí)

34、候需要染色？ 大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，菌落形態(tài)，細(xì)胞形態(tài) 革蘭氏染色及關(guān)鍵生化反應(yīng)； 生化鑒定 前 分離純化效果 酵母&細(xì)菌National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)2.微生物分離鑒定技術(shù)真菌的顯微觀察-酵母National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)真菌的顯微觀察-霉菌 玻片培養(yǎng)法培養(yǎng)基載玻片蓋玻片霉菌孢子懸液濾紙培養(yǎng)、觀察平皿National Institutes for Food and Drug Control2.微生

35、物分離鑒定技術(shù)重要生化試驗(yàn)：a) 氧化酶試 在分子氧參與下，將細(xì)胞色素C氧化，進(jìn)而將對(duì)苯二胺氧化為紫色的醌類物質(zhì)。b) 過氧化氫酶：將H O 解為H O和O ，產(chǎn)氣泡。222c) 凝固酶：使含有肝素等抗 劑的人或兔等血液發(fā)生凝固。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)染色、鏡檢表型鑒定生化組分鑒定技術(shù)序列分析基因型鑒定 核糖體分型PFGE、WGSNational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)自動(dòng)手動(dòng)生化鑒定National Institutes for F

36、ood and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)數(shù)值分類法：20世紀(jì)60年代，隨著計(jì)算機(jī)的應(yīng)用而將數(shù)值分類引入了細(xì)菌分類，一般選用50項(xiàng)以上的細(xì)菌生理、生化指標(biāo)，借助計(jì)算機(jī)分析各菌間的相似度，以此來劃分種和屬。包含的試驗(yàn)類型： 常 生化 胞外酶實(shí)驗(yàn)：無需微生物生長，憑分泌到細(xì)胞外的酶顯示顏色 糖發(fā)酵（ 化）試驗(yàn)：含糖類及PH指示劑，檢測利用碳源的形式 同化試驗(yàn)：利用僅含單一碳源的培養(yǎng)基檢測微生物對(duì)唯一碳水化合物或醇類的利用能力 抑制試驗(yàn)： 利用抗生素、毒性底物檢測微生物的生長與否和被抑制的程度National Institutes for Food and Drug Contro

37、l2.微生物分離鑒定技術(shù)National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)檢測微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致的顏色變化（吸光度）以及由于微生物生長造成的 度差異。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)71 Carbon Source + 23Chemical SensitivityAssays Gen II

38、I 鑒定板：好氧 菌(包括部分兼性厭氧菌) AN鑒定板：厭氧菌 YT鑒定板：酵母 FF鑒定板：絲狀真菌 大部分為霉菌，含部分假絲酵母)National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)純培養(yǎng)接種讀數(shù)GENE：可邊培養(yǎng)邊讀數(shù)，也可終點(diǎn)讀數(shù)AN& YT& FF ：終點(diǎn)讀數(shù)制備菌懸液GENE：90-98%T；62- %TAN：65%T 2%YT：47%T 2%FF：75%T 2%培養(yǎng)GENE：33N：35-37National Institutes for Food and Drug Control& FF：262.微生物分離鑒定技術(shù)Na

39、tional Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)染色、鏡檢表型鑒定生化組分鑒定技術(shù)序列分析基因型鑒定 核糖體分型PFGE、WGSNational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-TOF MS 微生物細(xì)胞中核糖體蛋白指紋圖譜 MALDI是1987年以后由F.Hille kamp和K.Tanaka等人正式確立的“軟電離” 方法，基質(zhì)輔助電離方式對(duì)樣品的破壞性小,質(zhì)量測定范圍大,分子量測定準(zhǔn)確。National Institutes

40、for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)純培養(yǎng)樣品制備測定結(jié)果分析得分結(jié) 解釋2.000-3.0001.700-1.999種水平屬水0.000-1.699 沒有可信的鑒定結(jié)National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR ） 通過紅外光譜讀取微生物菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)所有組成成分化學(xué)鍵的振動(dòng)情況,提供整個(gè)微生物菌體生化組成成分的光譜定量信息。標(biāo) 示譜段(cm-1)3000-2800180

41、0-15001500-1200振動(dòng)類型代表的細(xì)胞組分CH伸縮振動(dòng)區(qū)酰氨（、 ）區(qū)混合區(qū)細(xì)胞膜脂肪酸細(xì)胞蛋白和肽類，DNA、RNA結(jié)構(gòu)白質(zhì)和脂肪酸，磷酯 1500-1400二級(jí)脂肪酸區(qū)C-O伸縮振動(dòng)區(qū)指紋區(qū)兩性細(xì)胞質(zhì)膜成分（蛋白質(zhì)和類脂）National Institutes for Food and Drug Control1200-900900-700細(xì)聚糖長鏈 肪酸2.微生物分離鑒定技術(shù)點(diǎn)樣純培養(yǎng)制備菌懸液測定數(shù)據(jù)處理National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)環(huán)境菌National Institutes for Food

42、 and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)表型鑒定小結(jié)： 范圍：細(xì)菌&真菌 優(yōu)勢(shì)：時(shí)間、通量、成本 局限：原理、數(shù)據(jù)庫National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)染色、鏡檢表型鑒定生化組分鑒定技術(shù)序列分析核糖體分型PFGE、WGS基因型鑒定National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)表型基因 現(xiàn)有的分類體系保守、穩(wěn)定 數(shù)據(jù)庫National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)Nation

43、al Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù) FDA Guidance for Industry- Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current GoodManufacturing PracticeGenotypic methods have been shown to be m re accurate and precise than traditional biochemicaland phenotypic techniques. These methods

44、are especially valuable for investigations into failures(e.g., sterility tes ; media fill contamination). However, appropriate biochemical and phenotypicmethods can be ed for the routine dentification of isolates.National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)染色、鏡檢表型鑒定生化組分鑒定技術(shù)序列分析基因型鑒定 核糖體分

45、型PFGE、WGSNational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)16S rRNA 保守性&可變性 普遍性23S+5S+34protein 長 適宜21proteintRNA16S3S5SInstitutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)真菌核糖體rRNAHypervariable domainSSU: Sma SubunitIntergenic spacer18S5.8sD125-28S5SD2SU Large SubunitITS: I ernal transcribed space

46、r 18S多用于屬以上的分類學(xué)定位及系統(tǒng)發(fā)育分析。 ITS區(qū)多用于真菌的鑒定。Candida, Cryptococcus， richosporon（絲孢酵母屬），Aspergillus D1/D2區(qū)是位于LSU中的 變區(qū)，常與ITS聯(lián)用進(jìn)行真菌鑒定。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)recA: Mycobacterium & BurkholderiarpoB: 350&450bprecN: Streptococcus & E. coli &Neisseria gonorrhoeaeSingle copyOthers:

47、 ppk, dnaj, gapA, pyrH, luxABE,ectBC, dnaA, pheS and dnaKrpoDRNA聚合酶Frankia & E coli.RPB1：Basidiomycota, zygomycota,Microsporidia-tubulin: PenicilliumTEF -1：FusariumrporpoCMycobacterium tuberculosisEnterococcus & La tic acid ba teriagyrA: B lus subtilis groupDNA螺 酶看家基因（housekeeping genes）：機(jī)體細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的一

48、類基因，維持細(xì)胞基本功能所必需，通常在所有細(xì)胞中均表達(dá)，且不受細(xì)胞狀態(tài)影響。常作為其他基因表達(dá)水平的參照。National Institutes for Food and Drug ControlgyrB: Bacillus cereus group2.微生物分離鑒定技術(shù)產(chǎn)物驗(yàn)證純培養(yǎng)核酸提取特異性擴(kuò)增比對(duì)測序純化National Institutes for Food and Drug Control系統(tǒng)發(fā)育分析2.微生物分離鑒定技術(shù)01核酸提取 G-& G+ 酵母 絲狀真菌0203特異性擴(kuò)增 體系 退火溫度物驗(yàn)證、質(zhì)控 陰性對(duì)照 合適的marker 純化National Institute

49、s for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)04測序、比對(duì) 測序產(chǎn)物質(zhì)控 比對(duì)數(shù)據(jù)庫、參數(shù)05遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育分析National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)n 優(yōu)勢(shì)：成本低數(shù)據(jù)庫重復(fù)性好n 點(diǎn)：分辨率（某些種間保守性強(qiáng)）基因名稱序列長度16S rRNA1.5kbgyrB1.21.4kb堿基替換率 1%/5000萬年0.7%0.8%/100萬年編碼蛋白 否DNA促旋酶B亞基功能核糖 組成成分DNA復(fù)制及超螺旋結(jié)構(gòu)維持National Institutes for Food and Drug C

50、ontrol2.微生物分離鑒定技術(shù)16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹（芽孢桿菌）National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)gyrB 系統(tǒng)發(fā)育樹（芽孢桿菌）National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù) Strain typing: Strain typing is an integral part of epidemiological investigat

51、ions in clinical andpublic health microbiology. Methods including pulsed-field gel electrophoresis, ribotyping,arbitrarily primed polymerized chain reaction, and whole genome ordered restriction or opticalmap ng can be used to demonstrate that microbial species are the same strain and most likely ar

52、efrom a common sourse.（USP 1113）菌株A菌株BNational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)核糖體分型（Ribotyping） 核糖體DNA在不同菌株中的拷貝數(shù)存在差異。 限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行酶切，菌株之間的酶切片段長度、數(shù)量存在差異，經(jīng)特異性探針標(biāo)記，形成菌株專一的指紋圖譜。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒

53、定技術(shù)純培養(yǎng)制備菌懸液熱處理，DNA制備SIM0.85則與鑒定結(jié)果同種，SIM0.9則與鑒定結(jié)果同一核糖體型。圖譜獲取National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE） 用于大分子DNA的分離，通過不斷改變電場的方向，使得包埋在瓊脂糖凝膠中的DNA隨之改變泳動(dòng)方向，DNA分子的大小將決定其在電場中的運(yùn)動(dòng)位置差異。 分離 小1kb10Mb的DNA分子，對(duì)象為整個(gè)基因組。 重復(fù)性好、分辨力強(qiáng)，被譽(yù)為細(xì)菌分子學(xué)分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Salmonell

54、a、Sta ylococcus aureus、Streptococcuspneumoniae、Cl tridium difficile、Klebsiella、Acinetobacte baumann裂解，去除RNase,蛋白質(zhì)限 性酶消化菌體包埋電泳結(jié)果分析National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)全基因組測序（Whole genome sequencing，WGS） 細(xì)菌基因組一般不超過10Mb，真菌基因組2Mb80Mb。nstitutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)基因型鑒定

55、小結(jié)： 范圍：細(xì)菌&真菌 優(yōu)勢(shì)：數(shù)據(jù)庫，溯源 局限National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分離鑒定技術(shù)-總結(jié)鑒定方法a) 原理/目的b) 數(shù)據(jù)庫：影響鑒定準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素c) 可操作性d) 定性：可重復(fù)性e 成本National Institutes for Food and Drug Control主要內(nèi)容制藥環(huán)境微生物微生物分離鑒定技術(shù)鑒定技術(shù)應(yīng)用National Institutes for Food and Drug Control3. 鑒定技術(shù)應(yīng)用多相鑒定Polyphasic taxonmy: Taxonmy that as

56、sembles and assimilates many levels of informationfrom molecular, physiological, morphological, serological, or ecological sources toclassify microorganism.（USP1113） 正交性（orthogonal）：不同的鑒定方法針對(duì)微生物不同的組分或活性進(jìn)行測定。 無序性（not seq ntial）：并非選取某一種方法，未得到鑒定結(jié)果，然后再去實(shí)驗(yàn)另一種方法以 得結(jié)果 所有的方法都是同時(shí)進(jìn)行，以提供充分的信息以達(dá)到鑒定目的。National I

57、nstitutes for Food and Drug Control3. 鑒定技術(shù)應(yīng)用 在實(shí)踐應(yīng)用中，應(yīng)用場景和成本限制了多相分類鑒定的應(yīng)用 根據(jù)實(shí)際需求，按照順序，疊加使用鑒定方法達(dá)到鑒定目的 微生物鑒定技術(shù)用戶需求 經(jīng)驗(yàn)證的數(shù)據(jù)庫：局限、更新 成本：經(jīng)濟(jì)、時(shí)間、人員 樣品制備： 否需要前期染色鏡檢結(jié)果、是否對(duì)培養(yǎng)條件有限制 鑒定范圍：考慮日常需鑒定微生物種類 分型能力：考慮溯源調(diào)查需求 報(bào)告： 是否能夠鑒定真菌National Institutes for Food and Drug Control3. 鑒定技術(shù)應(yīng)用設(shè)備空氣 Pseudomonas spp.假單胞菌（潮濕含水表面） Cl

58、adosporium spp. 枝孢屬，Stachybotrys spp. 葡萄穗霉屬,and Aureobasidium pullulans出芽短梗霉屬 Aspergillusspp.曲霉, Penicillium spp. 青霉制藥環(huán)境 Corynebacterium s p. 棒狀桿菌 Aspergillus spp. 曲霉 Penicillium spp. 青霉人員 Acinetobacter spp.不動(dòng)桿菌 Alcaligenes spp. 產(chǎn)堿桿菌 Lipophilic yeasts 親脂性酵母菌 Der atophyte fungi 皮膚真菌 Pseudomonas spp.假

59、單胞菌 Alcaligenes .產(chǎn)堿桿菌屬水系統(tǒng) Stenotrophom s spp.寡養(yǎng)單胞菌 Burkhold ia cepaci 洋蔥伯克霍爾德菌 Burkhol eria picketti 皮氏伯克霍爾德菌 Methylobacterium 甲基桿菌屬 Serratia spp.沙雷氏菌National Institutes for Food and Drug Control Flavobacterium spp.黃桿菌3. 鑒定技術(shù)應(yīng)用 Ribotyping PFGE菌株3無菌檢查陽性、模擬灌裝rRNA測序（某些種如M. aloeverael&M. yunnanensis無法區(qū)分

60、）+DNA雜交A/B級(jí)區(qū)、無菌檢查陽性、模擬灌裝種水平2 16S rRNA 革蘭氏染色+自動(dòng)生化 MALDI TOF屬/種水平1常規(guī)環(huán)境監(jiān)測，非關(guān)鍵區(qū)域Micrococcus spp.National Institutes for Food and Drug Control3. 鑒定技術(shù)應(yīng)用 Ribotyping PFGE菌株3無菌檢查陽性、模擬灌裝 16S rRNA測序+housekeeping gene（gyrB）培養(yǎng)基+11種生化（針對(duì)B.cereus group） MLSTA/B級(jí)區(qū)、無菌檢查陽性、模擬灌裝種水平2 16S rRNA測 革蘭氏染色+自動(dòng)生化 MALDI TOF屬/種水平