細胞生物學實驗手冊：整裝培養(yǎng)細胞生物膜系統(tǒng)的光鏡和透射電鏡標本制備及觀察

1、實驗十八 整裝培養(yǎng)細胞生物膜系統(tǒng)的光鏡和透射電鏡標本制備及觀察【實驗目的】在相差顯微鏡和透射電子顯微鏡下，觀察整裝培養(yǎng)細胞中生物膜系統(tǒng)的結(jié)均和分布?！緦嶒炗闷贰?一、材料和標本 非洲綠猴腎上皮細胞（CV-1）。 二、器材和儀器 普通顯微鏡、相差顯微鏡、透射電子顯微鏡、鎳網(wǎng)、載玻片、蓋玻片、直徑5cm培養(yǎng)皿、CO2培養(yǎng)箱。 三、試劑 高錳酸鉀固定液、10g/ml秋水仙素、PBS(Ph7.4)、0.5Formvar液?！緦嶒瀮?nèi)容】 一、原理 本室宋今丹教授于1984年研制出一種新的高錳酸鉀固定液，用以固定整裝培養(yǎng)細胞。該固定液能除掉細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)成份，而保留膜的脂類成分，其結(jié)果，細胞骨架和細胞內(nèi)可

2、溶性蛋白質(zhì)等被去除，增加了標本的透明度，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體、溶酶體等生物膜系統(tǒng)被完整地保存下來。高錳酸鉀固定劑在固定標本的過程中，能形成二氧化錳，可在細胞的各種膜結(jié)構(gòu)的脂類親水端形成微細的沉淀，結(jié)果標本不需染色，即能在相差顯微鏡和透射電鏡下清晰地顯示細胞生物膜系統(tǒng)全貌。二、方法 （一）高錳酸鉀固定法顯示用藥(秋水仙素處理)前后CV一1細胞生物膜系統(tǒng)光鏡標本的制備及觀察。 1取無菌蓋玻片，分別放入二個直徑5cm的培養(yǎng)皿中，接種CV一1細胞，加3ml培養(yǎng)基。加蓋做好標記，移入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。其中一個培養(yǎng)皿在終止培養(yǎng)前4小時，加入10gml秋水仙素0.3ml。在倒置顯微鏡下觀察選

3、定長有鋪展良好細胞的蓋玻片，終止培養(yǎng)，倒掉培養(yǎng)液。 2PBS液沖洗蓋玻片二次，清除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。 3取出蓋玻片，將長有鋪展良好細胞的蓋玻片，細胞面朝上放在載片上。 4滴新配制的高錳酸鉀固定劑于蓋玻片上，固定10分鐘。 5蒸餾水輕輕地沖洗標本的細胞面5次，去除殘留固定液。 6取下蓋玻片，用濾紙吸干多余水份，滴1滴PBS液于載玻片上，將蓋玻片附有細胞面朝下，裝片。 (二)高錳酸鉀固定液顯示用藥(秋水仙素處理)前后CVl細胞生物膜系統(tǒng)電鏡標本的制備及觀察。 1用0.5Formvar液制做支持膜。將覆有Formvar膜的鎳網(wǎng)經(jīng)紫外線燈滅菌后，放入直徑5cm的無菌培養(yǎng)皿中。加培養(yǎng)基3m1。 2

4、接種CV一1細胞于鋪有支持膜的鎳網(wǎng)上，一組是不經(jīng)藥物處理的作為對照組，另一組是經(jīng)lOgml秋水仙素處理的作為實驗組。實驗組的培養(yǎng)細胞在終止培養(yǎng)前4小時加入10gm|秋水仙素0.3ml，放入CO2培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。 3待細胞鋪展開后，取出鎳網(wǎng)，用乳頭吸管滴1滴高錳酸鉀固定液于鎳網(wǎng)上，固定細胞10分鐘。 4經(jīng)上升梯度乙醇系列脫水：305070859095100，每次脫水3分鐘。 5待鎳網(wǎng)晾干后，在透射電子顯微鏡下(75KV電壓)進行觀察。 三、結(jié)果 在光鏡下和透射電子顯微鏡下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈網(wǎng)狀鋪展于整個細胞質(zhì)內(nèi)。細胞核周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成較稠密三維結(jié)構(gòu)，遠離細胞核周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則呈松散的網(wǎng)狀伸展至細胞邊

5、緣。在電鏡下可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由細管和扁囊構(gòu)成。除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外，還可看到粗大的呈條索狀的線粒體，也可觀察到高爾基器和溶酶體等膜性結(jié)構(gòu)。 CV一1細胞經(jīng)秋水仙素處理后，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細胞核周圍聚集，細胞邊緣區(qū)域不再觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。秋水仙素破壞微管結(jié)構(gòu)，因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布可能與微管的存在有密切關(guān)系?！咀?業(yè)】l為什么經(jīng)高錳酸鉀固定液固定的整裝培養(yǎng)細胞可以觀察生物膜系統(tǒng)?2為什么高錳酸鉀固定液固定細胞后，細胞不經(jīng)染色便可在電鏡下進行觀察?3CV一1細胞在秋水仙素處理后其生物膜系統(tǒng)的分布有何變化?請談談你的看法。 附：鎳網(wǎng)Formvar(聚乙烯醇縮甲醛)膜制備 1將載玻片插入0.5Formvar的氯仿溶液中，抽出。待干燥后用刀片