堆肥樣品DNA提取

1、3堆肥樣品DNA提取3.1堆肥樣品的預(yù)處理DNA提取前對所有樣品進(jìn)行洗滌。取堆肥樣品1.0g于5 ml離心管內(nèi)，加入3ml TENP buffer(50mmol-L-1 Tris-HCl， 20mmol-L-1 EDTA，100mmol-L-1 NaCl，pH=10.0)，充分渦 旋2min，5000 r/min離心10min，沉淀再次洗滌；沉淀加入3mL 120mmolL-1的磷酸鹽緩沖 溶液(pH=8.0)，充分渦旋混合，5000 r/min離心10min，洗滌直至上清液顏色較為澄清，沉 淀用于后續(xù)研究。DNA提取采用改進(jìn)的蛋白酶K-CTAB法進(jìn)行。1、 在洗滌好的樣品中加入 1.5mLD

2、NA 提取液(100mmolL1 Tris-HC1，pH=8.0， 100mmolL-1 EDTA，pH=8.0，100mmolL-1 Na3PO4，1.4molL-1 NaCl，2% CTAB)，劇烈振蕩 混勻后加入溶菌酶和蛋白酶K (均為10gL， 100mg-mL-1)o2、將混合好的樣品置于37C、225 r/min搖床上搖動40min，加入200gL (10%) SDS， 65C水浴2h，每隔15-20min輕輕上下顛倒搖動。3、沉淀在室溫6000r/min下離心10min，取上清，轉(zhuǎn)移至新的5ml離心管中，再加入 0.5mLDNA提取液和50(10%)的SDS，65C水浴10min

3、，重復(fù)操作后，合并上清。4、在獲得的上清液中加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1)，輕輕顛倒30min混合。 6000r/min下離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的5mL離心管；同樣操作3次，最大可能洗 去多糖、蛋白質(zhì)的污染。在上清液中加入0.6倍體積異丙醇室溫沉淀1h，11000r/min下離心 10min，棄上清。5、沉淀以1ml冰預(yù)冷的70%乙醇輕微振蕩洗滌，4C下以13000r/min離心3min；沉淀 再以0.7ml冰預(yù)冷的無水乙醇再次輕微振蕩洗滌，4C下以13000r/min離心2min。6、沉淀自然風(fēng)干，加入250應(yīng)TE緩沖液溶解DNAo 取 6應(yīng)進(jìn)行電泳走樣，確認(rèn)粗提 效果

4、。將粗提得到的DNA置于-20C保存。DNA的純化根據(jù)本實驗堆肥的特點，采用北京天根生化有限公司生產(chǎn)的普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒 純化DNA，以期能夠盡可能去除其中的各類雜質(zhì)。由于堆肥中的雜質(zhì)含量相比其他環(huán)境樣 品，雜質(zhì)含量更高。因此，如果DNA純化的方法能夠有效的去除堆肥樣品DNA，則也一定會適用于其他樣品。此試劑盒采用獨(dú)特的離心吸附柱純化DNA片段，具有快速多樣高效等優(yōu)點。操作步驟如下：1、柱平衡步驟：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500gL平衡液BL， 12000r/min離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2重新放回收集管中。按照以 上方法提取到的DNA為粗提的DNA

5、，其中含有大量的其他雜質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、RNA， 最主要的是含有酶促反應(yīng)抑制劑腐殖酸類物質(zhì)，因此，粗提DNA溶液還需要經(jīng)過純化，才 能夠用于PCR、DGGE等后續(xù)的分析。2、估計PCR反應(yīng)液的體積，向其中加入5倍體積的結(jié)合液PB，充分混勻。將所得溶 液加入一個吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2分鐘，12000r/min離心1min， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。注意：吸附柱容積為800gL，若樣品 體積大于800gL可分批加入。3、向吸附柱CB2中加入700應(yīng)漂洗液PW （使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000r/min離心1min，倒掉收集管中的

6、廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。4、向吸附柱CB2中加入500應(yīng)漂洗液PW，12000r/min離心1min，倒掉廢液。5、將吸附柱CB2放回收集管中，12000r/min離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱 CB2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。6、將吸附柱CB2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液 EB，室溫放置2分鐘。12000r/min離心2分鐘收集DNA溶液。樣品使用前于-20C保存。3.41%瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)是DNA分子片段的分子量測定和分子構(gòu)象研究以及DNA分離純 化的重要實驗手段。DNA分子在瓊脂糖凝

7、膠電泳中泳動時受到電場驅(qū)動力和凝膠的摩擦阻 力。一般情況下，單位長度雙鏈DNA帶有幾乎相等的電荷，故在一定電場強(qiáng)度下，DNA 分子的遷移速度取決于凝膠的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。DNA分子的遷 移速度與相對分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系，具有不同長度的DNA片段由于其泳動速度不同 而得到分離。具有相同一級結(jié)構(gòu)但構(gòu)型不同的DNA分子也可以通過這種方法進(jìn)行分離。粗 提和純化過程之后，可以通過此方法來觀察所提取DNA的效果如何。其操作步驟為：1、準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉0.75g，置于錐形瓶中，向其中加入1ml 50XTAE，再加入50ml 超純水，用玻璃棒攪拌均勻，置于電爐上加熱至瓊脂糖熔化。放置一邊冷卻，待溫度降下來， 倒入帶有梳齒的合適大小的模具中，厚度適中，室溫冷卻。2、待膠完全凝結(jié)后，小心拔出梳子，輕輕撕去封邊膠帶，將凝膠安放到電泳槽內(nèi)，加 樣孔一側(cè)靠近陰極。3、向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1mm。4、向DNA樣中加入溴酚蘭和SYBR Green I核酸染料，混勻后，加入樣孔中。5、加樣完畢后，關(guān)上電泳槽蓋，接好電極插頭DNA應(yīng)向陽極（紅色插頭