實驗三預習報告 硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性的測定

1、實驗三、硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性的測定一、硝酸還原酶的測定原理：硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關鍵酶，它催化植物體內的硝酸鹽還 原為亞硝酸鹽，產生的亞硝酸鹽與對-氨基苯磺酸（或對-氨基苯磺酰胺）及a- 萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸 還原酶活性可由產生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以每克鮮重含氮量表示，即以 ug.g-i.h-i為單位。NR的測定可分為活體法和離體法?；铙w法步驟簡單，適合快 速、多組測定。離體法復雜，但重復性較好。試劑亞硝酸鈉標準溶液：準確稱取分析純NaNO20.9857g溶于去

2、離子水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即為含亞硝態(tài)氮lug.ml-1的標準液;0.1molpH7.5 的磷酸緩沖液：Na2HPO4.12H2O30.0905g 與 NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去離子水溶解后定容至1 000ml；1% （W/V）溶液：1.0g對氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L -1HCL中（25ml濃 鹽酸加水定容至100ml即為3 mol.L-1HCL）；0.02% （W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml去離子水中，貯于棕色瓶中；_0.1mol.L-1KNO3 溶液：2.5275g KNO3 溶于 250

3、Ml 0.1mol.L-1Ph7.5 的磷酸緩沖 液中；0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸緩沖液：8.864 0g Na2HPO412H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去離子水中；30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。方法;1.標準曲線制作:管號1234567亞硝酸鈉標準液00.20.40.81.21.62.0試劑蒸餾水2.01.81.61.20.80.40.0(ml)1%磺胺44444440.02%萘基乙烯胺4444444每管含亞硝態(tài)氮（ug）00.20.40.81.21.62.0搖勻后在25度下保溫30min，然后在540nm

4、下比色測定。以亞硝態(tài)氮（ug）為橫坐標（X），吸光值 為縱坐標（Y）建立回歸方程。2.樣品中硝酸還原酶活力測定在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培養(yǎng)苗的水中就可以誘導酶的產生。稱取作物葉片0.5g （共3份，剪成1cm左右的小段（均勻），放入3只三角瓶中，其中 1份作對照，另外2份作酶活性測定用。反應：先向對照三角瓶中加入 1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入 9ml 0.1mol/LKNO3溶液，混勻后立即放入干燥器中，抽氣30分鐘（期間幾次通入空氣，再 抽真空，使葉片完全沉入瓶底，后在25C黑暗中反應0.5小時，分別向測定瓶（對照 瓶除外）加入1ml30%三

5、氯乙酸終止酶反應。比色測定：將各瓶搖勻靜置2min后，各取2ml反應液，加入1ml磺胺，搖勻后再加入1ml萘基乙烯胺，再在35C水浴中顯色15min，后比色，540nm空白溶液：2ml蒸餾水+1ml磺胺+1mla -萘胺。同樣和樣液一樣進行水浴15min。結果計算尤X vV 1單位鮮重樣品中硝酸還原酶活性=m g/ （g .h）W X t式中：為反應液酶催化產生的亞硝態(tài)氮總量，p g ； V1為提取酶時加入的緩沖液體積， ml；匕為酶反應時加人的粗酶液體積，ml； W為樣品鮮重，g； t為反應時間，h。二、谷氨酰胺合成酶的活性的測定【原理】谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內氨同化的關鍵酶之一，在

6、ATP和Mg2+ 存在下，它催化植物體內谷氨酸形成谷氨酰胺。在反應體系中，谷氨酰胺轉化為谷氨?；惲u肟酸，進而在酸性條件下與鐵形成紅色的絡合物，該絡合物在 540nm處有最大吸收峰，可用分光光度計測定。谷氨酰胺合成酶活性可用產生的一谷氨酰基異羥肟酸與鐵絡合物的生成量來表示，單位p mol mg- 1protein h -1。也可間接用540nm處吸光值的大小來表示，單位A mg -1 protein h -1 o【儀器與用具】冷凍離心機；分光光度計；天平；研缽；恒溫水??；剪刀；移液管（2ml、 1ml）。【試劑】提取緩沖液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，內含 2mmol/L

7、 Mg2+，2mmol/L DTT， 0.4mol/L 蔗糖。稱取Tris （三羥甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4 - 7H2O, 0.1543g DTT （二硫蘇糖醇）和34.25g蔗糖，去離子水溶解后，用0.05 mol/L HCl調至 pH8.0，最后定容至250ml；反應混合液 A （0.1mol/L Tris-HCl 緩沖，pH7.4）：內含 80mmol/L Mg2+，20mmol/L 谷氨酸鈉鹽，20mmol/L 半胱氨酸和 2mmol/L EGTA，稱取 3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4 - 7H2O, 0.8628g 谷氨酸鈉鹽，0

8、.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去離子水溶解后，用0.1mol/L HCl調至pH7.4，定容 至 250ml；反應混合液B （含鹽酸羥胺，pH7.4）：反應混合液A的成分再加入80mol/L鹽酸羥胺，pH7.4；顯色劑（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3 和 0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl3 - 6H2O，去離子水溶解后，加5ml 濃鹽酸，定容至100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去離子水中（臨用前配制）?！痉椒ā?.粗酶液提取 稱取植物材料1g于研缽中，加3ml提取緩沖液，置冰浴上 研磨勻漿，轉移于離心管中，4C下15,000g離心20min，上清液即為粗酶液。 反應1.6ml反應混合液加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混勻， 于37C下保溫半小時，加入顯色劑1ml，搖勻并放置片刻后，于5,000g下離心 10min，取上清液測定540nm處的吸光值，以加入1.6ml反應混合液A的為對照。 粗酶液中可溶性蛋白質測定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考馬斯