流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第1頁 科研型 分選功效488nm激光 四色熒光(525、575、610、675nm）流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第2頁 一、流式細(xì)胞術(shù)原理 流式細(xì)胞儀發(fā)展起源于細(xì)胞計(jì)數(shù)自動化研究。其原理是被熒光染色單細(xì)胞或顆粒，經(jīng)過高速液流系統(tǒng)形成細(xì)胞柱，排列成單細(xì)胞依次經(jīng)過流動室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒光素細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生不一樣熒光信號，這些熒光信號能夠反應(yīng)細(xì)胞生物特征。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第3頁前向散射激光流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第4頁FCM液流系統(tǒng)（怎樣形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管鞘液管流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第5頁 近30年來流式細(xì)胞術(shù)在我國得到很快發(fā)展，應(yīng)用

2、范圍不停增大。當(dāng)前，流式細(xì)胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第6頁二、流式細(xì)胞術(shù)特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)速度快極短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，每秒可檢測上萬個(gè)細(xì)胞，甚至幾萬個(gè)細(xì)胞。多參數(shù)分析可同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞各種特征，取得單個(gè)細(xì)胞各種信息，也能夠依據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志不一樣把細(xì)胞群分為各亞群。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第7頁定性、定量分析細(xì)胞經(jīng)過熒光染色對單細(xì)胞一些成份，如：DNA、抗原或受體等進(jìn)行定性、定量分析。 靈敏度高 熒光能檢測到單個(gè)微粒上標(biāo)有熒光分子少于10、G2/M15或S20、G2/M5流式細(xì)胞術(shù)

3、實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第41頁2、 淋巴細(xì)胞亞群分析白細(xì)胞分化抗原（CD分子）命名：1982年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會聯(lián)合會，將全部抗體依據(jù)白細(xì)胞分化抗原反應(yīng)性類型劃分為25群，把每一群抗體稱為一個(gè)分化抗體群(Cluster of Differentiation，CD)，進(jìn)行編號、命名，即為單克隆抗體國際命名法。由CD抗體群識別分化抗原就稱為CD分子。當(dāng)前已經(jīng)有339個(gè)分化抗體群被判定并命名流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第42頁 流式細(xì)胞結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準(zhǔn)確分類計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞亞群，被認(rèn)為是血液中淋巴細(xì)胞免疫表型分析標(biāo)準(zhǔn)方法。血液淋巴細(xì)胞是一群特異性極強(qiáng)細(xì)胞，依據(jù)淋巴細(xì)胞功效及膜表面標(biāo)志，主要分為T淋巴細(xì)

4、胞(CD3+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)、NK細(xì)胞(CD16+56+/CD3-)三個(gè)亞群。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第43頁CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+ T淋巴細(xì)胞（CD3+）淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞（CD19+） NK細(xì)胞（CD16+56）+流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第44頁NK細(xì)胞:CD(16+56)+/CD3-B淋巴細(xì)胞:CD19+/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第45頁外周血淋巴細(xì)胞亞群標(biāo)識方法（表面標(biāo)識） 50ul+10ul對應(yīng)抗體 避光孵育15min 加Opt

5、iLyes C溶血素250ul 室溫10min PBS洗一次 上機(jī)分析抗體: CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三標(biāo)抗體CD19-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體CD16+56-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型對照流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第46頁淋巴細(xì)胞亞群檢測臨床意義： CD3+、CD4+、CD8+總數(shù)降低：細(xì)胞免疫功效低下 CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、惡性腫瘤（復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）、再生障礙性貧血等 CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)

6、降低：本身 免疫性疾、多發(fā)性硬化病、本身免疫性溶血性貧血 CD3+CD4+CD8+T細(xì)胞降低：見于免疫球蛋白缺乏癥、胸腺發(fā)育不良、嚴(yán)重免疫缺點(diǎn)病。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第47頁 NK CD(16+56) + 活性低下：腫瘤、白血病、本身免疫病、免疫缺點(diǎn)病等 NK+ CD(16+56) + 活性增高：多發(fā)性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（B病毒、皰疹病毒、肺TB）、習(xí)慣性流產(chǎn)等 CD19+B細(xì)胞降低：體液免疫抑制 CD19+B細(xì)胞增高：B細(xì)胞惡性增殖性疾?。ò籽。┝魇郊?xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第48頁3、 白血病免疫分型 FCM作為白血病輔助診療，免疫分型是急白血病診療關(guān)鍵技術(shù)。利用不一樣類型白

7、血病含有不一樣抗原表示特異性進(jìn)行分型：髓系、B淋巴系、T淋巴系、非系列特異性等。標(biāo)識方法：往往需要胞漿和胞膜同時(shí)標(biāo)識，一線抗體包含：胞漿（髓系-MPO，B淋巴系-CD79a, T淋巴系-cyCD3）,胞膜(髓系-CD13、CD117，B淋巴系-CD19、CD10, T淋巴系-CD3、CD2)等流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第49頁 采取CD45和側(cè)向散射(SSC）設(shè)門技術(shù)可將各細(xì)胞群分開，熒光從強(qiáng)大到弱：淋巴細(xì)胞群單核細(xì)胞成熟粒細(xì)胞原/幼細(xì)胞(白血病細(xì)胞)，而成熟紅細(xì)胞和血小板不表示。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第50頁正常骨髓流式細(xì)胞分布圖流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第51頁各系表示抗原造血干細(xì)胞：CD3

8、4、CD33髓系表示 ：CD13、CD14、CD33巨核細(xì)胞 ：CD61、CD41B細(xì)胞系：CD10 、CD19、CD20T細(xì)胞系：CD2、CD3、CD5、CD7NK細(xì)胞: CD16、CD56、CD57流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第52頁4、細(xì)胞因子檢測 細(xì)胞因子（CK）主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，也可由非免疫細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生。一個(gè)細(xì)胞可產(chǎn)生各種CK，一個(gè)CK也可由各種細(xì)胞產(chǎn)生。細(xì)胞因子分為4類：白細(xì)胞介素（lL）；干擾素（IFN）；造血生長因子；腫瘤壞死因子（TNF）。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第53頁血液中未活化白細(xì)胞內(nèi)無或僅極小量細(xì)胞因子，當(dāng)其被各種激活劑活化后，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子合成增加

9、并不停分泌到細(xì)胞外而發(fā)揮作用。所以，要測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子較為困難。通常應(yīng)用刺激劑（如：佛波脂）來刺激細(xì)胞因子分泌 ，同時(shí)加入一定濃度細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑（如：莫能霉素），使細(xì)胞因子合成后累積在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過細(xì)胞因子特異單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光染色，并結(jié)合膜表面抗原染色，進(jìn)行多色分析各種細(xì)胞內(nèi)合成細(xì)胞因子。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第54頁流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第55頁細(xì)胞因子檢測（IFN-r ，IL-4）：全血或單細(xì)胞+刺激素(佛波脂)和阻斷劑(莫能霉素) 37培養(yǎng)4-6h 加入細(xì)胞表面抗體(如CD3、CD4/CD8) 孵育20-30min PBS洗1次 加固定破膜劑 室溫15min 加入IFN

10、- r和IL-4抗體 孵育30min PBS洗兩次 FCM。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第56頁結(jié)果分析：利用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（FS）和側(cè)向散射（SS）圈出淋巴細(xì)胞，再用CD3+和SSC設(shè)門圈出T淋巴細(xì)胞，再用CD8-/CD3+設(shè)門選定T淋巴細(xì)胞亞群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第57頁5、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度Ca2+超載是細(xì)胞損傷主要標(biāo)志，造成DNA降解，促使細(xì)胞凋亡。 檢測 Fluo-3/Am是高特異性Ca2+熒光指示劑，能與Ca2+特異結(jié)合。Fluo-3它本身是親水性，不易

11、透過膜，依賴其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就輕易跨過質(zhì)膜進(jìn)入胞漿，在胞內(nèi)酯酶作用下，脫去AM重新生成親水性形式，首先不能再進(jìn)入細(xì)胞器，另首先易于在胞內(nèi)擴(kuò)散，與游離鈣離子結(jié)合，經(jīng)過檢測其熒光強(qiáng)度可反應(yīng)出細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度改變。 單細(xì)胞懸液+flour-3/AM 37C避光孵育40min PBS洗1次 上機(jī)檢測 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第58頁6、線粒體膜電位 線粒體膜電位（MMP）是線粒體功效主要參數(shù)，是評價(jià)線粒體功效敏感指標(biāo)，它大小直接反應(yīng)線粒體功效及數(shù)量，MMP下降，其氧化磷酸化功效障礙，使ATP產(chǎn)生降低，造成細(xì)胞凋亡和壞死。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第59頁MMP檢測原理及方法：Rh

12、odamine123（羅丹明123）、DiOC6、JC-1等各種親脂性陽離子熒光素都能被流式細(xì)胞分析用于作為檢測 MMP探針。這些親脂性熒光染料，對膜含有通透性，另外線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電位，線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)帶負(fù)電荷，當(dāng)它們與活細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，這些陽離子熒光素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就能特異地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比。 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第60頁 當(dāng)MMP降低后，線粒體內(nèi)熒光素會發(fā)生外漏，在細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低。檢測其熒光強(qiáng)度能反應(yīng)線粒體數(shù)量和MMP降低或喪失。操作：單細(xì)胞懸液（1*10 6 ）+1umol/LRh123 37 C,30min PBS洗兩次 上機(jī)檢測 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)

13、方法及應(yīng)用第61頁7、 FCM檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下，遵照本身程序結(jié)束其生命過程。細(xì)胞凋亡為一個(gè)可調(diào)控、主動細(xì)胞死亡過程，有很多促進(jìn)或抑制凋亡調(diào)控路徑存在，因而就能夠人為地誘導(dǎo)或抑制一些細(xì)胞凋亡，從而到達(dá)防病、治病目標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第62頁（1） Caspase家族 半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以無活性酶原形式存在細(xì)胞內(nèi)，需被水解加工后才能成為有活性片段?；罨疌aspase深入激活其它Caspase前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，是直接造成凋亡細(xì)胞解體蛋白酶系統(tǒng)，當(dāng)前已發(fā)覺15個(gè)Caspase家族組員，分別命名為Caspase1-15。在Caspase

14、家族組員中，Caspase-3是最主要指示蛋白酶。 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第63頁操作：單細(xì)胞懸液（1*10 6） 固定和破膜劑 冰浴20min Perm/Wash Buffer洗兩次 20ul單抗 室溫孵育30min Perm/Wash Buffer洗1次 加0.5ml Perm/Wash Buffer 上機(jī)檢測。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第64頁（2） 凋亡相關(guān)基因蛋白細(xì)胞凋亡過程中有各種基因蛋白參加調(diào)控。凋亡相關(guān)基因可分兩類：誘導(dǎo)凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、 ced基因家族等。 抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad 等 促凋亡基因:bax、bak、bcl-

15、XS等 染色標(biāo)識同Caspase流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第65頁（3）Fas/FasL Fas又稱APO-1，即CD95分子，是細(xì)胞膜上跨膜蛋白，表示在各種組織細(xì)胞，是經(jīng)典細(xì)胞死亡受體。Fas/FasL是凋亡誘導(dǎo)家族主要組員之一，是調(diào)整組織發(fā)育和體內(nèi)平衡主要分子,Fas/FasL結(jié)合,可向細(xì)胞傳遞死亡信號,引發(fā)細(xì)胞凋亡。 檢測：同表面標(biāo)識流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第66頁（4） 凋亡率檢測被認(rèn)為比較成熟方法：PI單染色法Annexin VPI雙染法。TUNEL法流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第67頁碘化丙啶（PI）單染法（DNA周期分析）：因?yàn)榈蛲黾?xì)胞DNA被降解，小分子DNA可經(jīng)過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外

16、，另外凋亡小體也可帶走個(gè)別DNA，造成凋亡細(xì)胞DNA含量降低，與熒光染料結(jié)合降低，熒光強(qiáng)度減弱，在DNA直方圖上顯示在G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)DNA含量降低亞二倍體峰，稱凋亡細(xì)胞峰。 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第68頁流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第69頁流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第70頁Annexin VPI雙染法：在凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變中，胞膜改變是最早。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)層翻轉(zhuǎn)，暴露在凋亡細(xì)胞表面，組成早期凋亡主要生化特征，PS被特異Annexin V-FITC探針?biāo)鶚?biāo)識，而PI對細(xì)活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞是拒染，故Annexin V-FITC/PI雙染法能區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第71頁機(jī)械損傷細(xì)胞： Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、壞死細(xì)胞：Annexin V +/PI+早期凋亡細(xì)胞： Annexin V +/PI-活細(xì)胞： Annexin V -/PI-流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第72頁流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用第73頁TUNEL法：細(xì)胞凋亡時(shí)，雙鏈DNA會出現(xiàn)斷裂點(diǎn)，即產(chǎn)生一系列3 端。