【翻譯】【獨(dú)家首發(fā)】抗氧化劑硫辛酸的藥理作用

1、綜述抗氧化劑硫辛酸的藥理作用Gerreke Ph. Biewenga, Guido R. M. M. Haenen* and Aalt Bast萊頓/阿姆斯特丹藥物研究中心，VRIJE大學(xué)，藥物化學(xué)系，分子藥理學(xué)部， DE BOELELAAN，1083, 1081 HV 阿姆斯特丹, 荷蘭 : 31-20-4447610; : 31-20-4447582摘要 1.硫辛酸是目前現(xiàn)有的治療作用與抗氧化活性相關(guān)的藥物中的一個(gè)范例。 2. 抗氧化活性是一個(gè)相對(duì)概念：它取決于氧化應(yīng)激的種類(lèi)以及易被氧化底物的種類(lèi)如DNA，脂類(lèi)，蛋白質(zhì)等。3硫辛酸在體外最終的抗氧化作用是由其濃度及抗氧化特性所決定。其抗氧化

2、特性包括：金屬螯合能力，活性氧自由基去除能力，再生內(nèi)源性抗氧化劑的能力及修復(fù)氧化損傷的能力。4. 二氫硫辛酸 (DHLA)是由復(fù)原硫辛酸而生成，其抗氧化能力比硫辛酸更強(qiáng)。DHLA和硫辛酸均具有金屬螯合和ROS去除作用，但只有DHLA能夠再生內(nèi)源性抗氧化劑和修復(fù)氧化損傷。5. 作為金屬螯合劑，硫辛酸通過(guò)螯合Fe2+ 和Cu2+離子發(fā)揮抗氧化作用，而DHLA通過(guò)螯合Cd2+離子產(chǎn)生抗氧化活性。6. 作為ROS去除劑，大多數(shù)試驗(yàn)的結(jié)果均觀察到硫辛酸和DHLA的抗氧化作用，然而在特定情況下也觀察到它們的促氧化活性。但是，硫辛酸可以作為抗氧化劑能夠?qū)笵HLA的促氧化作用。7. DHLA能夠再生內(nèi)源性抗

3、氧化劑，如維生素E，維生素C及谷胱甘肽。 8. DHLA可以為肽甲硫氨酸亞砜復(fù)原酶提供復(fù)原當(dāng)量。該作用有助于增強(qiáng)氧化損傷蛋白的修復(fù)，如1-抗蛋白酶。9. 通過(guò)硫辛酰胺脫氫酶介導(dǎo)的硫辛酸復(fù)原作用，除NAPDH庫(kù)外，細(xì)胞還可以依靠NADH庫(kù)發(fā)揮抗氧化功能，該NADH庫(kù)在氧化應(yīng)激反響通常被大量損耗。10. 在藥物相關(guān)的抗氧化劑藥理學(xué)中，硫辛酸是一種模式化合物，增進(jìn)了人們對(duì)抗氧化劑在藥物治療中作用方式的了解。GEN PHARMAC 29;3:315-331, 1997. 1997 Elsevier Science Inc.關(guān)鍵詞 抗氧化劑藥理學(xué)，二氫硫辛酸，谷胱甘肽，硫辛酸，新陳代謝，金屬螯合作用，肽

4、甲硫氨酸亞砜復(fù)原酶，活性氧自由基，去除，維生素C，維生素E抗氧化劑藥理學(xué)在藥理學(xué)中，抗氧化劑藥理學(xué)是人們關(guān)注的一個(gè)新的研究領(lǐng)域。然而在20世紀(jì)初， P. Ehrlich指出大局部藥物是通過(guò)與DNA或蛋白質(zhì)受體，酶，載體分子，離子通道結(jié)合而發(fā)揮作用。最近以來(lái)，藥物影響機(jī)體功能的其它機(jī)制正為人們所接受,作為抗氧化劑的藥物也可以影響機(jī)體的功能?？寡趸芯款I(lǐng)域的開(kāi)創(chuàng)者B. Halliwell對(duì)抗氧劑的定義進(jìn)行了明確描述：，能夠在與可被氧化的底物相比擬低的濃度水平存在的情況下顯著延遲或阻止這種底物的氧化的任何物質(zhì)均是抗氧劑(Halliwell, 1995)。就這個(gè)定義而言，抗氧劑對(duì)于那些想保存物質(zhì)的人很

5、有意義：這些人包括放射藥劑師、食品科學(xué)工作者、博物館館長(zhǎng)等。人體也需要很好地進(jìn)行保護(hù)。維生素C、維生素E及谷胱甘肽能夠保護(hù)組織防止氧化性損傷。當(dāng)然，機(jī)體組織中含有天然的保護(hù)劑的概念已為人所熟知。機(jī)體中發(fā)生的多種氧化過(guò)程受到特定抗氧劑的精細(xì)調(diào)控。在某種情況下，氧化及抗氧化的平衡將被打破，并傾向氧化過(guò)程。這種情況就導(dǎo)致氧化應(yīng)激并最終可能會(huì)引起病理變化。抗氧化劑藥理學(xué)是研究對(duì)氧化過(guò)程進(jìn)行干預(yù)治療可能性的學(xué)科(Bast, 1994)。 具體而言，實(shí)施途徑包括兩方面圖1.。第一條途徑集中在現(xiàn)有的藥物或有潛在價(jià)值的藥物上。通過(guò)抗氧化活性試驗(yàn)對(duì)化合物的進(jìn)行篩選并評(píng)價(jià)其抗氧化作用對(duì)治療效果的奉獻(xiàn)。第二條途徑集

6、中在病理學(xué)方面。對(duì)病理過(guò)程進(jìn)行研究，內(nèi)容涉及病理?yè)p傷及有關(guān)的氧化應(yīng)激反響。在目前現(xiàn)有的藥物中，治療作用與抗氧化活性有關(guān)的一個(gè)例子是硫辛酸(Bast et al., 1988)。將兩種途徑結(jié)合起來(lái)發(fā)揮有效的治療作用是最為理想的情況。在本綜述中，我們主要討論第一條途徑：內(nèi)容涉及硫辛酸的抗氧化活性方面的研究。圖1. 抗氧化劑藥理學(xué)研究對(duì)氧化過(guò)程進(jìn)行治療干預(yù)的可能性硫辛酸硫辛酸(化學(xué)名： 1,2-二硫戊環(huán)-3-戊酸，圖2)存在于所有真核和原核細(xì)胞中。硫辛酸是幾種2-酮酸脫氫酶的組份，參與能量代謝。硫辛酸通過(guò)與2-酮酸脫氫酶多酶復(fù)合物的酪氨酸殘基連接作為酶的輔酶(Fujiwara et al., 199

7、5; Morris et al., 1995)。硫辛酸與?；鶊F(tuán)結(jié)合，并將他們從一個(gè)酶復(fù)合物轉(zhuǎn)移給另一個(gè)復(fù)合物。在此過(guò)程中，硫辛酸被復(fù)原成二氫硫辛酸DHLA，后者隨后被硫辛酰胺脫氫酶(Lip- DH)再次氧化用以合成NADH?？傊蛐了岷虳HLA作為對(duì)氧化復(fù)原對(duì)，負(fù)責(zé)將脫氫酶的底物來(lái)源的電子傳遞給NAD+。圖 2. 二氫硫辛酸、硫辛酸及-硫辛酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)手性中心 (*).R-構(gòu)型是天然存在的構(gòu)型。1966年，德國(guó)生理學(xué)家開(kāi)始給肝硬化、毒蕈中毒、重金屬中毒及糖尿病多發(fā)神經(jīng)病變的病人使用硫辛酸。最初的使用依據(jù)來(lái)源于肝硬化、糖尿病及糖尿病多發(fā)神經(jīng)病變的病人體內(nèi)的硫辛酸水平下降的臨

8、床觀察結(jié)果。研究者認(rèn)為補(bǔ)充硫辛酸能夠有助于逆轉(zhuǎn)缺乏狀況，并能繼而修復(fù)2-酮酸氧化反響。事實(shí)上，硫辛酸輔酶的功能損傷也可能在病理發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在砷中毒情況下，As 3+在2-酮酸脫氫酶的作用下能與硫辛酸生成一種復(fù)合物從而被滅活。在某些肝病病人的血清中能檢測(cè)到識(shí)別多酶復(fù)合物中的硫辛酸化亞單位的自身抗體(Gut et al., 1995; Tuaillon et al., 1992)。此外，脫氫酶復(fù)合物附近發(fā)生的氧化應(yīng)激能夠?qū)е卵趸怨δ軗p傷(Gutierrez Correa and Stoppani, 1996)，從而對(duì)硫辛酸作為輔酶的功能造成不利影響。由于體內(nèi)硫辛酸與蛋白質(zhì)結(jié)合，因而在

9、人體中未能檢測(cè)到游離的硫辛酸(Hermann et al., 1996)。 但是治療給藥后就能在循環(huán)系統(tǒng)中檢測(cè)到游離的硫辛酸(Teichert and PreiB, 1995)。藥物的治療作用很可能是由游離的、未結(jié)合的硫辛酸產(chǎn)生的。在重金屬中毒的情況下，游離硫辛酸及其代謝產(chǎn)物能夠捕獲循環(huán)系統(tǒng)的重金屬，從而阻斷其損傷作用，并在某種情況下促進(jìn)其排泄。在糖尿病多發(fā)神經(jīng)病變病人中，游離的硫辛酸可以進(jìn)入神經(jīng)組織中，阻斷葡萄糖相關(guān)的氧化損傷作用。 尤其對(duì)糖尿病多發(fā)神經(jīng)病變而言，通過(guò)病理學(xué)及藥物相關(guān)的途徑，抗氧化劑藥理完全有可能成為新的治療方法。研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)氧化應(yīng)激是糖尿病病理過(guò)程的一個(gè)組成局部。氧化應(yīng)

10、激可能是非胰島素依賴(lài)性糖尿病發(fā)病中的一個(gè)因素(Salonen et al., 1995)。 Wolff et al. (1991) 的結(jié)果說(shuō)明高糖能夠引起氧化應(yīng)激。在鏈脲菌素大鼠糖尿病模型上，使用抗氧化劑及硫辛酸能夠延遲多發(fā)性神經(jīng)病的發(fā)生(Cameron et al., 1993; Nagamatsu et al., 1995; Vertommen et al., 1994)。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示3周短期硫辛酸給藥不能改善病人的多發(fā)性神經(jīng)病病癥。硫辛酸能夠減輕病人的神經(jīng)病主訴，如疼痛及感覺(jué)異常(Ziegler et al., 1995)。盡管氧化應(yīng)激在人類(lèi)糖尿病發(fā)病中的作用尚在研究之中途徑2，已有

11、的研究結(jié)果為進(jìn)一步探討硫辛酸抗氧化活性在氧化應(yīng)激的作用奠定了堅(jiān)實(shí)根底途徑1。氧化應(yīng)激機(jī)體行使功能的根底是有充足的能量供給。需氧生物體通過(guò)葡萄糖和脂肪酸等燃料分子的氧化作用產(chǎn)生能量。在氧化反響過(guò)程中，來(lái)自燃料分子的電子隨后被傳遞給其它分子，直至到達(dá)最終的電子受體：O2。氧化應(yīng)激通常發(fā)生在O2復(fù)原調(diào)控紊亂的情況下。如前所述，氧化應(yīng)激過(guò)程中的一個(gè)重要分子是O2 (Halliwell and Gutteridge, 1989)。在基態(tài)，O2有兩個(gè)未成對(duì)電子，分布在*反鍵分子軌道上圖3。單線態(tài)是氧的更為活潑的狀態(tài)：1gO2 和1g+O2，能量分別比基態(tài)O2高22.4 和 37.5 kcal。O2增加一個(gè)

12、單電子時(shí)，該電子進(jìn)入其中一個(gè)*反鍵分子軌道上。這種產(chǎn)物就是超氧自由基O2 -，該分子上只有一個(gè)為成對(duì)電子。如果再增加一個(gè)電子將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)非自由基分子：過(guò)氧離子O22-。該分子在質(zhì)子存在的情況下會(huì)生成H2O2。由于O2 -和O22-有額外電子進(jìn)入到反鍵軌道，因而氧-氧鍵能就會(huì)下降。O22-增加兩個(gè)以上的電子時(shí)由于電子進(jìn)入*2p軌道將氧-氧鍵將完全被破環(huán)，從而產(chǎn)生2O2-自由基?？偠灾?，在生理情況下，O2的兩電子復(fù)原產(chǎn)物為H2O2，四電子復(fù)原產(chǎn)物為H2O。 某些過(guò)渡金屬可離子能參與O2的復(fù)原反響鏈。氧化型金屬離子，如Fe3+和Cu2+, 能促進(jìn)電子從一種氧自由基傳遞給另一種自由基。例如，在Fe3

13、+存在的情況下能加速O2的歧化反響：Fe 3+ + O2 - Fe 3+ + O2 (1)Fe 2+ + O2 - + 2H + Fe 3+ + H2O2 (2)2 O2 - + 2H + O2 + H2O2 (3)復(fù)原型金屬離子，如Fe2+和Cu+，能夠提供一個(gè)電子因而啟動(dòng)整個(gè)反響過(guò)程。其中一個(gè)例子是Fenton 反響，反響產(chǎn)物是非?；顫姷牧u自由基(OH) ：Fe2+ + H2O2 中間復(fù)合物Fe 3+ + OH + OH - (4)非常微量的Fe 3+即能進(jìn)一步與H2O2發(fā)生反響，盡管該反響在正常生理pH情況下的速度很低： Fe3+ + H2O2 中間復(fù)合物 Fe2+ + O2 - +2H

14、+ (5)其它可能的反響還包括： OH + H2O2 H2O + H + + O2 - (6)O2 - + Fe3+ Fe2+ + O2 (7) OH + Fe2+ Fe3+ + OH - (8)這些反響的總和為鐵離子催化的過(guò)氧化氫的分解：2H2O2 O2 + 2H2O (9)在需氧生物體內(nèi)，幾乎所有的O2復(fù)原步驟都是由金屬離子催化完成的。金屬離子的反響性的調(diào)控主要是通過(guò)與金屬離子與某種酶結(jié)合。這些酶包括超氧歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶及細(xì)胞色素酶。從蛋白環(huán)境中解離出來(lái)后，金屬離子參與其它非機(jī)體需要的繼發(fā)反響如Haber-Weiss反響。SOD的蛋白環(huán)境阻斷金屬催化的O2 - 和H2O2之間的反響

15、，但是非結(jié)合的鐵和銅離子卻能誘導(dǎo)羥基自由基的產(chǎn)生：Fe3+ + O2 - Fe 2+ + O2 (10)Fe2+ + H2O2 OH + OH - + Fe 3+ (11)O2 - + H2O2 OH + O2 + OH - (12)在無(wú)鐵離子存在的情況下，Haber-Weiss反響的速度幾乎為零。該結(jié)果說(shuō)明鐵和銅在例子在 OH生成中的具有重要作用。 H2O2和OH以及其它氧來(lái)源的自由基，如1gO2和HOCl ，能夠損傷DNA、蛋白質(zhì)脂質(zhì)分子。人們通常稱(chēng)它們?yōu)榛钚匝踝杂苫鵕OS。許多ROS都是來(lái)源于 O2 -。O2 -是氧毒性作用的主要因子，這就是已被人所熟知的關(guān)于氧毒性作用的超氧化物理論。在

16、體內(nèi)，超氧陰離子的可以通過(guò)多種途徑生成。首先，某些重要的生物大分子及外源物能在O2 存在的情況下被氧化生成O2 -：這些分子包括甘油醛、復(fù)原型核黃素、血紅蛋白、腎上腺素、四氫蝶啶、硫醇、百草枯及阿霉素。其次，線粒體電子傳遞鏈及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也能泄露電子給O2。 在線粒體中，細(xì)胞色素氧化酶、NADH-輔酶 Q 復(fù)原酶及復(fù)原型輔酶Q本身都是電子泄露的部位。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，細(xì)胞色素P-450 酶不正確的反響也能將電子泄露給O2。O2 -的第三個(gè)來(lái)源是吞噬細(xì)胞。這些細(xì)胞含有膜結(jié)合性酶如NADPH氧化酶，該酶能夠按照下面的化學(xué)反響式催化合成O2 - 。NADPH + 2O2 2O2 - + H + + NADP +

17、 (13) ROS的毒性作用通常是吞噬細(xì)胞殺滅微生物的效應(yīng)機(jī)制。盡管所有的ROS均來(lái)自O(shè)2復(fù)原反響，但是并非所有的ROS都來(lái)源于O2 - 。例如NO 是由NO合酶在類(lèi)似P-450 反響的氧化過(guò)程中生成的(Boucher et al., 1992)。在此過(guò)程中，復(fù)原型氧被整合到NOH-L-精氨酸中間體中 (Nathan, 1992)。當(dāng)帶有單個(gè)或多個(gè)未成對(duì)電子的化合物為小分子且能自由擴(kuò)散時(shí)，人們稱(chēng)之為“自由基。從這一點(diǎn)而言，ROS-如O2、O2 - 、 OH 及軌道上帶有未成對(duì)電子的金屬離子都被認(rèn)為是自由基。除了某些反響外，大局部的化學(xué)反響都可以被認(rèn)為是極性或自由基反響。在極性反響中，富電子反響

18、物提供一對(duì)電子給貧電子反響物形成化學(xué)鍵。相反，在自由基反響中，各反響物僅提供一個(gè)電子以形成新化學(xué)鍵。生物學(xué)家多年來(lái)一直認(rèn)為生物體中不存在自由基。但是在生物體內(nèi)觀察到的自由基反響結(jié)果已經(jīng)開(kāi)啟了一個(gè)新的研究方向：“自由基研究。盡管這個(gè)術(shù)語(yǔ)從歷史根底上講符合邏輯，但是從化學(xué)方面講還難以講通。研究者認(rèn)為該術(shù)語(yǔ)適用于研究“自由基，例如“自由陰離子。目前科學(xué)家已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這種術(shù)語(yǔ)的奇怪性，并著手深入了解整個(gè)氧化反響鏈，而忽略不管它們是否具有自由基特性還是或具有極性性質(zhì)。圖 3. 二價(jià)氧分子的分子軌道能勢(shì)抗氧化劑為了控制體內(nèi)的氧化過(guò)程，生物體配置了多種抗氧化機(jī)制?？寡趸溉鏢OD、過(guò)氧化氫酶及過(guò)氧化物酶都與O

19、2 -和H2O2的去除有關(guān)?？梢酝ㄟ^(guò)“沒(méi)收金屬離子以抑制失控的O2 - 的歧化反響、Fenton 反響和Haber-Weiss反響。ROS可以在水相環(huán)境中能被小分子化合物如維生素C、谷胱甘肽及尿酸去除掉。在脂質(zhì)環(huán)境中，維生素E可以去除自由基保護(hù)胞膜結(jié)構(gòu)。當(dāng)抗氧化系統(tǒng)功能下降時(shí)，內(nèi)源性大分子的損傷仍有可能被修復(fù)，原因在于機(jī)體內(nèi)還含有DNA修復(fù)系統(tǒng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換機(jī)制及肽甲硫氨酸亞砜復(fù)原酶(PMSR)。如前所述，藥物也具有抗氧化活性?？傮w而言，藥物的抗氧化能力取決于它們的化學(xué)和物理性質(zhì)。綜合性質(zhì)及濃度決定了它們的最終的抗氧化活性。為了產(chǎn)生抗氧化效果，藥物及其相關(guān)的代謝產(chǎn)物必須能夠進(jìn)入到易發(fā)生氧化應(yīng)激的

20、組織中。在抗氧化劑藥理學(xué)中，研究?jī)?nèi)容涉及藥物的吸收、分布、代謝及排泄。此外，也研究藥物及其代謝產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)。為了評(píng)價(jià)硫辛酸的抗氧化性質(zhì)，進(jìn)行了以下四個(gè)方面的研究：1. 金屬螯合能力；2. ROS去除能力；3. 再生內(nèi)源性抗氧化劑的能力；4. 在損傷修復(fù)系統(tǒng)中的作用。以上四種性質(zhì)可以按照純粹的化學(xué)反響進(jìn)行研究。通過(guò)評(píng)價(jià)它們對(duì)抗氧化損傷作用來(lái)評(píng)價(jià)其相應(yīng)的抗氧化活性。抗氧化活性評(píng)價(jià)包括體內(nèi)和體外試驗(yàn)。有關(guān)硫辛酸的生物利用度、代謝及抗氧化活性評(píng)價(jià)的試驗(yàn)內(nèi)容將在下面章節(jié)進(jìn)行綜述。圖 4. 健康志愿者禁食一晚口服1g R-硫辛酸后的硫辛酸空心圓、3-酮硫辛酸實(shí)心圓及bisnorlipoic acid三

21、角形的血漿濃度-時(shí)間曲線。口服R-硫辛酸85 分鐘后進(jìn)食高脂食品。使用裝有電化學(xué)檢測(cè)器的高效液相色譜檢測(cè)各化合物的濃度。硫辛酸的生物利用度我們每日的飲食中都含有硫辛酸，尤其是來(lái)源于那些具有高代謝活性的組織的食物中存在著大量的硫辛酸 (Herbert and Guest, 1975; Mattulat and Baltes, 1992)。肉類(lèi)食品如代謝性器官-豬心中的硫辛酸含量為1.1-1.6 mg/kg，而腓腸肌中的硫辛酸含量?jī)H為0.07-0.15 mg/kg (Mattulat and Bakes, 1992)。該結(jié)果顯示飲食中的大局部硫辛酸來(lái)自于多酶復(fù)合物。蛋白水解酶不能有效剪切硫辛酸和賴(lài)

22、氨酸之間的肽鍵。因而，研究者認(rèn)為食物消化后，硫辛酸是以硫辛酰賴(lài)氨酸形式被機(jī)體吸收的(Martulat, 1992)。此外，機(jī)體可以利用脂肪酸和半胱氨酸從頭合成硫辛酸(Carreau, 1979; Spoto et al., 1982)。 研究結(jié)果顯示硫辛酸的合成為蛋白質(zhì)結(jié)合方式 (Spoto et al., 1982)。從食物攝取或生物合成的硫辛酸中，只有極少局部以游離形式進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。口服給藥后，游離硫辛酸的量相對(duì)較大。治療藥物劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)從飲食中的攝取量。大鼠靜脈注射使用劑量高達(dá)10 mg/kg，而人體的靜脈注射劑量高達(dá)1200 mg，折算起來(lái)約相當(dāng)于1000 kg豬心中的硫辛酸含量。給藥

23、后，可以在血漿(Teichert and PreiB, 1995)和組織(Maitra et al., 1996)中檢測(cè)到硫辛酸。最初有關(guān)硫辛酸的檢測(cè)方法都包括一個(gè)水解步驟，以便將硫辛酸從酪氨酸殘基上解離下來(lái)。由于人們認(rèn)為游離態(tài)的硫辛酸是發(fā)揮治療作用最重要的形式，目前的研究都對(duì)游離硫辛酸的含量進(jìn)行了分析(Biewenga et al., 1996c; Handelman et al., 1994; Hermann et al., 1996)。 圖4中的結(jié)果顯示，健康男性志愿者口服1 g R-硫辛酸后血漿中游離硫辛酸的含量高達(dá)1,154 ng/ml。Hermann等 (1996) 廣泛研究了硫辛

24、酸消旋體的不同劑型的藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度。結(jié)果顯示，硫辛酸的血漿半衰期約為30 min圖4也可以得到同樣結(jié)果。硫辛酸的平均總血漿去除率與肝臟血流量在相同的范圍內(nèi)(約為 11-17 ml/ min kg)。由此可以推測(cè)肝臟是硫辛酸主要去除器官。硫辛酸的絕對(duì)生物利用度(Fabs) 計(jì)算值在20% 和38%之間，與異構(gòu)體和劑型有關(guān)。 目前還不清楚藥物的生物利用度和抗氧化活性介導(dǎo)的藥理作用之間的關(guān)系。但是致死劑量和生物利用度之間似乎存在某種關(guān)系。生物利用度的結(jié)果為口服和其它給藥途徑之間的LD50值的差異提供了解釋 (表 1)。 基于這些數(shù)據(jù)進(jìn)行外推，人體可以耐受克級(jí)劑量的硫辛酸。實(shí)際上，目前尚無(wú)人體

25、使用1g 硫辛酸后出現(xiàn)嚴(yán)重副反響的報(bào)道。給86個(gè)糖尿病病人靜脈注射1200 mg硫辛酸后，28人出現(xiàn)惡性或嘔吐不良反響(Ziegler et al., 1995)。 肌肉注射40 mg藥物后，有病例報(bào)道注射部位發(fā)生灼痛 (von Schreiber, 1961 )。表 1. 硫辛酸動(dòng)物半數(shù)致死劑量給藥途徑 大鼠LDs0 小鼠LD50 p.o. 1,130 mg/kg 502 mg/kg i.p. 200 mg/kg 160 mg/kg s.c. 230 mg/kg 200 mg/kg i.v. 180 mg/kg 210 mg/kg 摘自Lewis 和Sweet的研究報(bào)告， 1985。圖 5.

26、 LipDH 催化從外消旋硫辛酸方塊和R-硫辛酸圓圈合成DHLA的初始速率。為了進(jìn)行比照，將使用外消旋硫辛酸得到的速率乘以2。在前60 s, 使用巰基試劑二硫雙硝基苯甲酸DTNB在1.0 mM NADH存在的情況下，在500nm波長(zhǎng)處檢測(cè)生成的DHLA。參加LipDH (5 g/ml)啟動(dòng)反響。硫辛酸的體內(nèi)代謝復(fù)原反響 硫辛酸能被復(fù)原成二巰基化合物DHLA圖2.。由于該復(fù)原型硫辛酸是硫辛酸在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化活性的重要形式，人們對(duì)這種復(fù)原反響的機(jī)制進(jìn)行了研究。二硫化物可以被其他巰基化合物復(fù)原。在正常情況下，體內(nèi)巰基化合物谷胱甘肽復(fù)原型，GSH的含量很高。從原理上說(shuō)GSH能夠復(fù)原硫辛酸分子內(nèi)的二硫鍵

27、。但是，該反響的速率極低以至于從未觀察到GSH對(duì)硫辛酸大量的復(fù)原反響發(fā)生(Biewenga et al., 1996b)。硫辛酸的復(fù)原更重要的是依靠酶促反響。在線粒體中， LipDH 也能催化2-酮酸脫氫酶的逆反響。它能通過(guò)消耗NADH催化游離硫辛酸的復(fù)原反響。在胞漿中，GSH 復(fù)原酶通過(guò)消耗NADPH催化復(fù)原反響的進(jìn)行。值得注意的是，兩種酶具有相反的立體特異性。哺乳動(dòng)物的GSH復(fù)原酶催化S-型硫辛酸的速度為R-型硫辛酸的兩倍(Pick et al., 1995)。哺乳動(dòng)物的LipDH 復(fù)原R-硫辛酸對(duì)映體的速度約為S-型對(duì)映體的28倍 (Biewenga et al., 1996a; L6f

28、felhardt et al., 1995)。用于臨床治療的硫辛酸是一種外消旋混合物。最初人們認(rèn)為S-硫辛酸是LipDH的弱性底物，有可能占據(jù)其活性位點(diǎn)，從而抑制R-硫辛酸的復(fù)原反響。研究結(jié)果說(shuō)明S-硫辛酸確實(shí)能夠抑制LipDH的酶活性(Biewenga et al., 1996a; L6ffelhardt et al., 1995)。但是，當(dāng)在飽和濃度的NADH存在的情況下(高于0.1 mM)，使用外消旋混合物時(shí)并未觀察到DHLA合成減少圖5。顯然， R-DHLA 的合成并不受到S-硫辛酸的影響。因此，應(yīng)當(dāng)將S-硫辛酸看作是外消旋硫辛酸LipDH 依賴(lài)性復(fù)原反響的立體異構(gòu)擴(kuò)展底物。但是，外消

29、旋硫辛酸復(fù)原反響的立體特異性沒(méi)有預(yù)先想得那樣嚴(yán)格。DHLA是一種強(qiáng)效復(fù)原劑，它能復(fù)原二硫基，也能復(fù)原硫辛酸分子內(nèi)的二硫鍵。使用外消旋硫辛酸后，R-DHLA 和S硫辛酸將在同一細(xì)胞空間內(nèi)共存，將會(huì)發(fā)生一種異構(gòu)體被其它復(fù)原型異構(gòu)體以非酶促反響形式復(fù)原。除了GSH復(fù)原酶催化的復(fù)原反響，S-DHLA還可以以非酶催化方式復(fù)原R-硫辛酸。該結(jié)果說(shuō)明不能將難復(fù)原性R-硫辛酸認(rèn)為是立體異構(gòu)最正確底物?？傮w而言，從理論上講，復(fù)原外消旋混合物的效果要優(yōu)于分別復(fù)原兩種異構(gòu)體的效果。由于在體內(nèi)DHLA高度活潑而無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。例如在人血漿中，DHLA進(jìn)入機(jī)體后快速與血漿組份發(fā)生反響(Biewenga et al., 1

30、996c; Teichert and Preil, 1995)。但是使用人紅細(xì)胞和大鼠晶狀體證實(shí)了DHLA在體內(nèi)的合成(Constantinescu et al, 1995)。給新生大鼠使用硫辛酸時(shí)，外消旋形式的硫辛酸比R-或S-型硫辛酸產(chǎn)生更多的DHLA。與該結(jié)果相符的是，外消旋硫辛酸對(duì)丁胱亞磺酰亞胺BSO誘導(dǎo)的白內(nèi)障的保護(hù)作用強(qiáng)于兩種純異構(gòu)體(Maitra et al., 1996)。圖 6. 已經(jīng)得到鑒定的硫辛酸主要代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)-氧化反響硫辛酸的其它一種代謝反響為戊酸側(cè)鏈的-氧化反響圖6。在惡臭假單胞菌LP菌株中， bisnorlipoic acid、tetranorlipoic

31、acid 及-hydroxybisnorlipoic acid 是-氧化反響的主要代謝產(chǎn)物(Furr et al., 1978)。在大鼠尿液中，除上述3種代謝產(chǎn)物外，還檢測(cè)到一種酮類(lèi)產(chǎn)物(Spence and McCormick, 1976)。此外，CO2也是-氧化反響的一種代謝產(chǎn)物，通過(guò)分解三羧酸循環(huán)中的乙酰CoA而產(chǎn)生圖6。實(shí)際上，給大鼠使用1,6-14C硫辛酸后， 呼出氣體中含有14CO2 (Harrison and McCormick, 1974)。Harrison 和 McCormick的研究進(jìn)一步為-氧化反響提供了支持(1974)。將14C硫辛酸與線粒體制備物孵育后產(chǎn)生14CO2，

32、使用未標(biāo)記的脂肪酸時(shí)能夠降低14CO2的產(chǎn)生。 硫辛酸在人體中的代謝研究是最近才開(kāi)展的。研究發(fā)現(xiàn)人體同樣存在-氧化作用。在人血漿中能夠檢測(cè)到bisnorlipoic acid (圖4)。男性志愿者口服1g R-硫辛酸后，bisnorlipoic acid的最高濃度704 ng/ml出現(xiàn)在給藥189 min后(Biewenga et al., 1996c)。尿液中的主要代謝物為S4,S 6-dimethylbisnorlipoic acid (Locher et al., 1995)，結(jié)果說(shuō)明-氧化作用產(chǎn)物在經(jīng)尿液排泄前還被進(jìn)一步代謝?？傊珼HLA、bisnorlipoic acid、 -hy

33、droxybisnorlipoic acid及tetranorlipoic acid在體內(nèi)都有可能在硫辛酸的抗氧化效應(yīng)中發(fā)揮作用。研究者已經(jīng)開(kāi)展很多關(guān)于DHLA的抗氧化特性方面的研究。這局部將在下面章節(jié)中進(jìn)行綜述。但是bisnorlipoic acid和tetranorlipoic acid方面的抗氧化作用的研究開(kāi)展較少，其它代謝物方面那么尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。金屬螯合作用化學(xué)反響具有金屬螯合特性的化合物可以產(chǎn)生抗氧化作用，但也可能會(huì)充當(dāng)促氧化劑角色。當(dāng)在形成金屬被屏蔽的復(fù)合物中所有的O2 配位點(diǎn)都被占據(jù)時(shí)，就能產(chǎn)生抗氧化活性。此外，當(dāng)電子密度從金屬離子回撤到螯合劑時(shí)因電子不能被轉(zhuǎn)移給O2 時(shí)也能

34、產(chǎn)生抗氧化活性。當(dāng)存在空閑O2 配位點(diǎn)和金屬離子被復(fù)原時(shí)卻能產(chǎn)生促氧化作用。配體將電子轉(zhuǎn)移給金屬離子，隨后被轉(zhuǎn)移給O2。進(jìn)行Fe2+或Fe3+絡(luò)合的研究收獲甚微，因?yàn)樵谶@種條件下容易產(chǎn)生不溶性的氫氧化鐵。因而，在水溶液中進(jìn)行的鐵絡(luò)合作用的研究主要是通過(guò)取代的鐵螯合劑進(jìn)行的。研究結(jié)果說(shuō)明，在極性非水溶液中，硫辛酸能夠與Mn 2+, Cu 2+, Zn 2+, Cd2+和Pb2+形成復(fù)合物 (Sigel,1982; Sigel and Prijs, 1978)。此外，硫辛酸不能螯合Fe 3+ (Cornaro et al., 1985)。DHLA能夠螯合Co2+、N2+、Cu2+、Zn2+、Pb2

35、+ (Sigel, 1982)， Hg2+ (Brown and Edwards, 1970) 及Fe3+ (Comaro et al., 1985; Kawabata et al., 1995)，所形成的復(fù)合物在水中的溶解度很低。研究結(jié)果還說(shuō)明DHLA與Fe3+ 形成的復(fù)合物比與Fe2+形成的復(fù)合物更穩(wěn)定 (Bonomi et al., 1985)。硫辛酸代謝物tetranorlipoic acid及bisnorlipoic acid 能與Cu2+、Zn2+、Cd2+ 和 Pb2+形成復(fù)合物 (Sigel, 1982)。體外及體內(nèi)金屬螯合作用硫辛酸可能通過(guò)螯合鐵而產(chǎn)生抗氧化作用。該結(jié)論是建立

36、在OH去除分析的分析結(jié)果之上(Scott et al., 1994)。在該研究中，使用脫氧核糖作為指示分子。脫氧核糖與鐵結(jié)合后誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性的脫氧核糖降解。但是參加硫辛酸后，硫辛酸能夠?qū)⒚撗鹾颂菑拿撗鹾颂?鐵復(fù)合物中取代下來(lái)。以前的研究結(jié)果顯示硫辛酸不能螯合Fe 3+ (Cornaro et al., 1985)。因此可以推論硫辛酸通過(guò)螯合Fe 2+ 從而降低可被脫氧核糖檢測(cè)到的 OH的水平。一項(xiàng)脂質(zhì)過(guò)氧化研究也得到其金屬螯合作用方面的證據(jù)。在該研究中，通過(guò)將Fe2+或Fe3+與維生素C孵育誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。維生素C螯合鐵離子，并將其復(fù)原成Fe2+。隨后Fe2+能將一個(gè)電子轉(zhuǎn)移給氧或其它ROS從而

37、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。在等摩爾鐵離子和維生素C存在的情況下，硫辛酸能夠與維生素C競(jìng)爭(zhēng)鐵螯合作用，從而阻止脂質(zhì)過(guò)氧化(Scott et al., 1994)。 但是當(dāng)維生素C相對(duì)于鐵過(guò)量50倍時(shí)，硫辛酸無(wú)法與維生素C競(jìng)爭(zhēng)螯合鐵離子作用，也就不能阻止脂質(zhì)過(guò)氧化圖7(Bast and Haenen, 1988)。同樣，硫辛酸可以絡(luò)合Cu 2+，這一結(jié)果可以解釋硫辛酸對(duì)Cu 2+誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生保護(hù)作用的原因 (Ou et al., 1995)。圖 7. 脂質(zhì)過(guò)氧化的時(shí)間過(guò)程曲線。通過(guò)檢測(cè) HYPERLINK javascript:showjdsw(showjd_0,j_0) 硫代巴比妥酸(TBA) 反響

38、物的水平來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)過(guò)氧化水平。 與TBA反響后，在535 nm波長(zhǎng)測(cè)定生成產(chǎn)物的吸光度值600 nm用于校正蛋白沉淀。將大鼠肝微粒體與0.2 mM 維生素C和下面各組試劑孵育：(1) 不添加， (2) 0.5 mM DHLA，(3) 1 mM GSH，(4) 0.5 mM DHLA加上1 mM GSH，(5) 0.5 mM DHLA加上0.5 mM 氧化型谷胱甘肽 (GSSG)。單獨(dú)使用0.5 mM GSSG 或 0.5 mM 硫辛酸無(wú)作用，結(jié)果與反響1相同。The effect of 0.5 mM硫辛酸加上1 mM GSH與單獨(dú)使用1 mM GSH的反響 (3)的結(jié)果無(wú)差異。為了確保清晰性未

39、將后面的結(jié)果在圖中顯示。參加10 M Fe2+到所有反響中以啟動(dòng)反響。 DHLA對(duì)金屬離子的絡(luò)合作用也能夠產(chǎn)生抗氧化作用。Cd 2+誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)(Mtiller and Menzel, 1990)。但是，DHLA對(duì)于其它過(guò)渡金屬來(lái)說(shuō)是一種有效的復(fù)原劑，從而會(huì)引起促氧化作用。例如，DHLA很容易將 Fe3+復(fù)原成 Fe2+。該復(fù)原反響引起Fe2+升高，進(jìn)而會(huì)促進(jìn)Fe2+/維生素C誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化(Bast and Haenen, 1988; Scott et al., 1994) 。與對(duì)照組相比，TBARS 終濃度較高，也確證了其促氧化活性見(jiàn)圖7。當(dāng)然，這種促氧化活性可

40、能是Fe3+復(fù)原和維生素C共同作用的結(jié)果詳述見(jiàn)后?？傮w而言，DHLA會(huì)與其它金屬螯合分子發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。體外研究結(jié)果顯示，過(guò)量的DHLA能夠與鐵蛋白發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，從而鐵離子從鐵蛋白上釋放出來(lái)(Bonomi and Pagani, 1986)，但是尚不知道這種情況在體內(nèi)會(huì)不會(huì)發(fā)生?；衔锬芊窦铀貴e3+/博來(lái)霉素誘導(dǎo)的DNA降解常被用來(lái)評(píng)價(jià)其復(fù)原鐵離子產(chǎn)生的促氧化活性。然而，DHLA并不促進(jìn)Fe3+/博來(lái)霉素誘導(dǎo)的DNA降解(Scott et al., 1994)，說(shuō)明DHLA并不能將替代復(fù)合物中的博來(lái)霉素。在大鼠上觀察了硫辛酸通過(guò)金屬螯合活性發(fā)揮抗氧化活性。硫辛酸能夠阻斷Cd2+誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)腦、心

41、臟及睪丸的損傷作用(Sumathi et al., 1994)。ROS去除能力化學(xué)反響調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的一種方法是使用ROS去除劑。當(dāng)ROS和去除劑之間的反響速度高于ROS和其靶分子反響的速度時(shí)就能到達(dá)抗氧化效果圖8。在機(jī)體中，許多存在于組織及細(xì)胞內(nèi)外液中的生物大分子都可能成為ROS損傷的目標(biāo)。和所有的化學(xué)反響一樣，自由基去除反響的速率由去除劑的濃度及速率常數(shù)決定圖8中的k3。設(shè)計(jì)的評(píng)價(jià)化合物對(duì)ROS去除能力的試管實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻玫剿俣瘸?shù)方面的信息。兩種方法被用于評(píng)價(jià)化合物的ROS去除能力：競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)及監(jiān)測(cè)反響物濃度的時(shí)間過(guò)程試驗(yàn)。為了對(duì)不同方法進(jìn)行說(shuō)明，在此對(duì)次氯酸去除試驗(yàn)的原理加以詳述。與ROS去除

42、分析的原理相似，可以將體內(nèi)試驗(yàn)設(shè)計(jì)成圖8中所示的競(jìng)爭(zhēng)分析。在此方法中，去除劑與指示分子競(jìng)爭(zhēng)ROS。在無(wú)去除劑存在的情況下，指示分子產(chǎn)生可被檢測(cè)的信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)受試化合物對(duì)指示分子產(chǎn)生的信號(hào)的抑制程度來(lái)評(píng)價(jià)化合物的自由基去除能力。在許多去除評(píng)價(jià)方法中，所研究的ROS是不穩(wěn)定的物質(zhì)，必需在試管中產(chǎn)生。HOCl 可以由綠過(guò)氧化物酶/H2O2/C1系統(tǒng)產(chǎn)生。但是，HOCl 相對(duì)較為穩(wěn)定并且有商品化的產(chǎn)品可供使用。因而可以將該方法進(jìn)行簡(jiǎn)化，使用HOCl 替代HOCl 發(fā)生器(Winterbourn, 1985)。通過(guò)將HOCl 參加到去除劑和指示分子混合物中啟動(dòng)試驗(yàn)圖8。需要指出的是，去除劑和指示分子的

43、濃度是按照指示分子的含量能夠容易被分析儀器檢測(cè)到的方式進(jìn)行選擇的。其濃度未必在生理范圍內(nèi)。由于HOCl 和與之相適應(yīng)的指示分子之間的反響的速率常數(shù)尚屬未知，因而也無(wú)法計(jì)算去除反響的速率常數(shù)k3，圖8。 因此，給出的化合物的HOCl 去除能力評(píng)價(jià)結(jié)果只是等級(jí)得分。圖 8. ROS 去除的要素物質(zhì)。在體內(nèi)內(nèi)源性生物分子替代了指示分子。最近，F(xiàn)olkes et al. (1995)為了得到速率常數(shù)采用了第二種方法即監(jiān)測(cè)反響物濃度的時(shí)間過(guò)程。他們通過(guò)省略指示分子簡(jiǎn)化了HOCl去除試驗(yàn)。因而，他們的試驗(yàn)設(shè)計(jì)僅涉及HOCl的去除反響。通過(guò)測(cè)定下面的反響物中的其中一個(gè)進(jìn)行反響速率的計(jì)算：HOCl、 去除劑或

44、被氧化的去除劑。然而，某些高效的去除劑如GSH與HOC1反響速度很快而無(wú)法測(cè)定他們的速率常數(shù)。但是該方法的原理已經(jīng)成功被用于其它ROS的研究表2和表3。研究者已經(jīng)開(kāi)展了多種HOCl去除方面的試驗(yàn)，目的是對(duì)DHLA、硫辛酸、bisnorlipoic acid及tetranorlipoic acid的自由基去除能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。彈性蛋白酶分析的結(jié)果顯示所有以上的化合物均是很好的去除劑 (Biewenga et al.,1994; Haenen and Bast, 1991; Scott et al., 1994)。在該分析方法中，指示分子是1-抗蛋白酶(1-AP)。與HOCl 反響后，通過(guò)測(cè)定混合物的

45、剩余彈性蛋白酶對(duì)混合物的抑制能力來(lái)檢測(cè)剩余的1-AP (圖 9)。在TNB分析中，巰基化合物5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)為指示分子(Ching et al., 1994)。該研究只對(duì)硫辛酸進(jìn)行了評(píng)價(jià)，它比其它去除劑如S-甲基谷胱甘肽GSMe更為有效保護(hù)TNB。 未對(duì)DHLA進(jìn)行評(píng)價(jià)的原因是因?yàn)樗芘c被氧化的TNB發(fā)生反響而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。 在蛋白羰基分析中，牛血清白蛋白BSA被HOCl 氧化后產(chǎn)生蛋白羰基，該基團(tuán)可以使用2,4-二硝基苯肼進(jìn)行檢測(cè)。DHLA在所有受試品中是最有效的自由基去除劑。值得注意的是，硫辛酸在阻止蛋白羰基形成方面的作用要弱于GSMe。化合物在TNB和羰基分析中觀

46、察到的對(duì)HOC1去除活性的等級(jí)差異可能是因干擾反響造成的。巰基和胺類(lèi)化合物會(huì)干擾蛋白質(zhì)羰基的形成或它們會(huì)與羰基發(fā)生反響(ONeill et al., 1994)?？傮w上講，受試化合物對(duì)信號(hào)形成產(chǎn)生干擾是競(jìng)爭(zhēng)分析方法一個(gè)缺陷。總而言之，研究者設(shè)計(jì)了HOC1去除評(píng)價(jià)方法以得到反響的相關(guān)信息，即HOC1和去除劑之間的反響。在這方面提出三點(diǎn)需要明確之處。首先，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是ROS去除作用其實(shí)就是速度問(wèn)題。這點(diǎn)可以從-硫辛酸的結(jié)果可以看出。盡管-硫辛酸在彈性蛋白酶分析中能與HOC1發(fā)生反響，但是反響速度不夠快而缺乏以與1-AP競(jìng)爭(zhēng)(Biewenga et al., 1994)。其次， 在體內(nèi)HOC1去除反

47、響從來(lái)不是單一反響，而是伴隨著一系列反響。TNB和羰基分析中觀察結(jié)果的差異可能是由于這些反響造成的。由此引出第三點(diǎn)，抗氧化活性只是一個(gè)相對(duì)概念。硫辛酸可以保護(hù)TNB，而對(duì)BSA卻無(wú)保護(hù)作用。因而嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，當(dāng)認(rèn)為某個(gè)化合物具有抗氧化活性時(shí)，必需考慮其作用的靶分子。 硫辛酸及其代謝產(chǎn)物也能去除其它ROS。有關(guān)硫辛酸和DHLA的ROS去除能力進(jìn)行概述的內(nèi)容見(jiàn)表2和表3。如想獲得有關(guān)這些分析方法及結(jié)果的詳細(xì)內(nèi)容，讀者可以參考其它文獻(xiàn)資料(Halliwell, 1995; Packer et al., 1995; Scott et al., 1994)。ROS體外去除作用氧化應(yīng)激不是由單個(gè)反響引起的，而

48、是一系列自由基和非自由基反響引起的。氧化應(yīng)激的最終結(jié)果會(huì)造成蛋白質(zhì)、DNA或脂質(zhì)損傷。研究者開(kāi)展了多種方法來(lái)研究不同的氧化過(guò)程。在這其中，研究最深入的是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程(Halliwell and Gutteridge, 1989)。該氧化過(guò)程可以被進(jìn)一步細(xì)分為個(gè)事件圖10：?jiǎn)?dòng)反響，脂質(zhì)非過(guò)氧化氫依賴(lài)性反響和脂質(zhì)過(guò)氧化氫依賴(lài)性反響，及終末反響。啟動(dòng)反響為脂質(zhì)膜中的多不飽和脂肪酸上的奪氫反響：繼而，通過(guò)鏈?zhǔn)椒错懏a(chǎn)生越來(lái)越多的脂質(zhì)來(lái)源的自由基。當(dāng)兩個(gè)自由基形成一個(gè)穩(wěn)定的非自由基產(chǎn)物時(shí)鏈?zhǔn)椒错懖拍茏罱K停止。在脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中，能夠從以下兩種機(jī)制去除ROS的化合物具有抗氧化活性。首先，能去除啟動(dòng)氧化過(guò)

49、程的ROS的化合物。ROS去除的化學(xué)反響機(jī)制已經(jīng)在前面章節(jié)中提及。其次，能阻斷鏈?zhǔn)椒错懙目寡趸瘎┑幕衔?。例如維生素E是一種內(nèi)源性鏈?zhǔn)椒错懽钄嗫寡趸瘎?。它與中間自由基過(guò)氧及烷氧自由基，見(jiàn)圖10的反響速度要高于與能從周?chē)|(zhì)奪氫的自由基反響的速度。 硫辛酸和DHLA對(duì)微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的作用的結(jié)果見(jiàn)圖7。通過(guò)使用Fe2+-維生素C混合物產(chǎn)生ROS以啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)。 在該分析中，如果藥物有抗氧化作用，將會(huì)在ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化反響開(kāi)始之間產(chǎn)生一個(gè)滯后時(shí)間。然而，結(jié)果顯示硫辛酸和均未產(chǎn)生滯后時(shí)間，說(shuō)明在該分析中，兩者均未顯示出抗氧化活性。基于這個(gè)結(jié)果可以得出結(jié)論：兩種化合物均不能去除Fe2+/維生素C產(chǎn)生

50、的作為啟動(dòng)因子的ROS。此外，結(jié)果還說(shuō)明硫辛酸和DHLA都不是鏈?zhǔn)椒错懽钄嗫寡趸瘎?表2 硫辛酸對(duì)ROS的去除氧化劑效應(yīng)發(fā)生系統(tǒng)指示分子檢測(cè)反響物去除能力參考文獻(xiàn)O2-黃嘌呤氧化酶DMPO自旋阱(Suzuki et al., 1991)-次黃嘌呤氧化酶細(xì)胞色素C(Scott et al., 1994)H2O2-過(guò)氧化物酶(Scott et al., 1994)OH+H2O2 / Fe2+DMPO自旋阱DHLA=LA(Suzuki et al., 1991)+H2O2 / Fe2+氨基苯二酰肼(Suzuki et al., 1991)+H2O2/Fe2+/抗壞血酸脫氧核糖k=4.711010/

51、M/sec(Scott et al., 1994)+NP-發(fā)光DMPOk=1.921010/M/sec(Matsugo et al., 1995)+NP-發(fā)光BSA(Matsugo et al., 1995)+NP-發(fā)光水楊酸(Matsugo et al., 1995)+NP-發(fā)光Apo-B-蛋白(Matsugo et al., 1995)HOCl+1-APDHLA, GSH, LA GSMe GSSG, cystine(Haenen and Bast, 1991) (Biewenga et al., 1994)+TNPLA GSMe GSSG(Ching et al., 1994)+BSAD

52、HLA GSH GSMe LA cystine, GSSG(Yan eta/., 1996)CCl3O2+CCl4輻射分析CCl3O2k=1.8108/M/sec(Scott et a/., 1994)1gO2+紅烯自氧化紅烯k=1108/M/secbenzene(Stevens et al., 1974)+NDPO2熱分解1gO2k=1.3108/M/sec(Kaiser et al., 1989)ONOO-+酪氨酸DHLA, GSH LA GSSG(Whiteman et al., 1996)+1-APDHLA, LA, Met GSH GSSG(Whiteman et al., 1996

53、)ABAP-ABAP熱分解B-藻紅蛋白(Kagan et al., 1992)縮略詞： a1-AP, a-l-抗蛋白酶；ABAP, 2,2-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride；BSA，牛血清白蛋白；DHLA, 二氫硫辛酸；DMPO, 5,5 -dimethyl- 1-pyrroline-N-oxide；GSMe，S-甲基谷胱甘肽；LA，硫辛酸；NDPO2， 3,3-( 1,4-naphthylide )dipropionate的內(nèi)過(guò)氧化物; NP-III, N,N-bis(2-hydroperoxy-2-methoxyethyl)-l,4,5,8-n

54、aphthalene-tetracarboxylic diimide); TNB, 5-thio-2-nitrobenzoic acid.表 3 DHLA對(duì)ROS的去除氧化劑效應(yīng)發(fā)生系統(tǒng)指示分子檢測(cè)反響物去除能力參考文獻(xiàn)O2-+黃嘌呤氧化酶DMPO自旋阱k=3.3105/M/sec(Suzukiet al., 1991)+黃嘌呤氧化酶腎上腺素k=7.3105/M/sec(Suzuki et al., 1993)-次黃嘌呤氧化酶NBT(Scott et al., 1994)+細(xì)胞色素P450/阿霉素DMPO自旋阱k=4.8105/M/sec(Dikalov et al., 1996)+細(xì)胞色素P

55、450/阿霉素DHLAk=4.8105/M/sec(Dikalov et al., 1996)H2O2-H2O2(Haenen et al., 1990)-DHLA(Scott et al., 1994)OH+H2O2/Fe2+DMPO自旋阱DHLA=LA(Suzuki et al., 1991)-H2O2/Fe3+/維生素C脫氧核糖(Scott et al., 1994)HOCl+1-APDHLA,GSH,LAGSMe GSSG, cystine(Haenen and Bast, 1991)(Biewenga et al., 1994)+BSADHLA GSH GSMe LA cystine

56、, GSSG(Yan et al., 1996)CCl3O2+CCl4輻射分解CCl3O2k=2.107/M/sec(Scott et al., 1994)1gO2-NDPO2熱分析1gO2(Kaiser et al., 1989)+四甲基對(duì)苯醌光解1gO2k=5.7105/M/sec(Bisby et al., 1996)NO+巨噬細(xì)胞NO(以NO2-形式)(Burkat et al., 1993)ONOO-+酪氨酸DHLA, GSH LA GSSG(Whiteman et al., 1996)+1-APDHLA, LA, Met GSHGSSG(Whiteman et al., 1996)

57、ABAP+ABAP分解B-藻紅蛋白(Kagan et al., 1992)縮略詞： a1-AP, a-l-抗蛋白酶；ABAP, 2,2-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride；BSA，牛血清白蛋白；DHLA, 二氫硫辛酸；DMPO, 5,5 -dimethyl- 1-pyrroline-N-oxide；GSMe，S-甲基谷胱甘肽；LA，硫辛酸；NBT，硝基四偶氮藍(lán)；NDPO2， 3,3-( 1,4-naphthylide )dipropionate的內(nèi)過(guò)氧化物; TNB, 5-thio-2-nitrobenzoic acid。圖 9. DHLA (三角)

58、, lipoic acid (實(shí)心圓)及-硫辛酸 (空心圓)的HOCl去除能力。在參加50 M HOCl之前，將受試化合物與20 g l-AP混合。以其生理功能形式表示指示分子l-AP的剩余量。 通過(guò)使用N-t- BOC-L丙氨酸 p-硝基苯酚酯作為底物來(lái)測(cè)定彈性蛋白酶的抑制百分比。在410 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)分解產(chǎn)物的生成速率。 當(dāng)使用2,2-azobis(2,4-dimethyl-valeronitrile (AMVN)熱解法啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反響時(shí)得到不同的結(jié)果表4。該分析的結(jié)果顯示，硫辛酸具有中等強(qiáng)度的抗氧化作用，而DHLA那么是一種很好的抗氧化劑(Kagan et al., 1992)。該結(jié)

59、果可以用DHLA能夠阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反響的啟動(dòng)來(lái)解釋。DHLA可能能夠去除啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反響的AMVN自由基，因?yàn)橐延醒芯匡@示DHLA能夠去除結(jié)構(gòu)與之相似的ABAP自由基表3。 圖10. 脂質(zhì)過(guò)氧化反響的順序。 LH 是一種多不飽和脂肪酸， LOOH 是相應(yīng)的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物?；衔镌贔e2+-維生素C和AMVN誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反響中呈現(xiàn)的不同作用效果再次說(shuō)明術(shù)語(yǔ)“抗氧化劑的相對(duì)性。除了靶分子種類(lèi)的重要性外，氧化反響的種類(lèi)也很關(guān)鍵。大局部體外ROS去除試驗(yàn)中，氧化應(yīng)激反響均與某種疾病病因相關(guān)。這些評(píng)價(jià)關(guān)注的中心是可被氧化的底物如，蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)、細(xì)胞及器官。對(duì)于硫辛酸和DHLA，研究者開(kāi)展R

60、OS去除試驗(yàn)以觀察它們的抗氧化活性表4?；诓煌趸瘧?yīng)激及不同欲施加保護(hù)對(duì)象的組織的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可以得出如下結(jié)論：硫辛酸和DHLA均能在體外通過(guò)去除ROS而發(fā)揮抗氧化作用。體內(nèi)ROS去除作用研究者開(kāi)展了多個(gè)實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)硫辛酸和DHLA體內(nèi)抗氧化活性表5。大局部的體內(nèi)試驗(yàn)都使用假定氧化應(yīng)激可能參與疾病發(fā)生的某種動(dòng)物模型。例如鏈脲菌素被用于糖尿病動(dòng)物模型。鏈脲菌素能夠誘導(dǎo)血糖升高從而引起氧化應(yīng)激。因此氧化應(yīng)激或多或少與該疾病過(guò)程有關(guān)。但是，通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)也能誘發(fā)氧化應(yīng)激。如1-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP;表5) 及四氧嘧啶圖1