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1、植物的器官培養(yǎng)課件植物的器官培養(yǎng)課件【學(xué)習(xí)目的要求】 1一般掌握離體根培養(yǎng)的取材部位和培養(yǎng)基的選擇。2掌握莖尖培養(yǎng)的種類和操作步驟。3掌握莖段培養(yǎng)中材料的選擇、處理及培養(yǎng)基的調(diào)整。4掌握離體葉片的培養(yǎng)步驟。5一般掌握胚胎培養(yǎng)的類型與各自的注意事項(xiàng)。6.掌握如何防止培養(yǎng)過程中外植體的褐化和玻璃化。7.掌握植物器官組織培養(yǎng)常見問題的原因及對(duì)策【學(xué)習(xí)目的要求】 1一般掌握離體根培養(yǎng)的取材部位和培養(yǎng)基的【主要內(nèi)容】第一節(jié)營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)一、離體根培養(yǎng) 二、莖尖培養(yǎng) 三、莖段培養(yǎng) 四、離體葉培養(yǎng) 第二節(jié)生殖器官培養(yǎng)一、花器官和種子培養(yǎng) 二、胚胎培 三、胚珠培養(yǎng) 第三節(jié) 植物器官組織培養(yǎng)常見問題及對(duì)策【主要內(nèi)
2、容】第一節(jié)營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)第一節(jié)營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)一、離體根培養(yǎng) 離體根培養(yǎng)特點(diǎn):因?yàn)楦瞪L(zhǎng)快,代謝強(qiáng),變異小,加上無菌,不受微生物干擾,可根據(jù)研究需要,改變培養(yǎng)的成分來研究其營(yíng)養(yǎng)吸收、生長(zhǎng)和代謝的變化。 應(yīng)用:研究根系生理和代謝變化;也可由根細(xì)胞再生成植株,不僅證明根細(xì)胞的全能性,也產(chǎn)生了無性繁殖系,用于生產(chǎn)實(shí)踐。 第一節(jié)營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)一、離體根培養(yǎng) 一、離體根培養(yǎng) 培養(yǎng)方法: 1培養(yǎng)基 用無機(jī)離子濃度低的White培養(yǎng)基,也可用MS、B5等,但濃度為2/3或1/2。White培養(yǎng)基配方為:硝酸鉀80,硫酸鎂720,硫酸錳7,硫酸銅0.03,碘化鉀0.75,Vpp0.5,VB6 0.1,VB1 0.1
3、,甘氨酸3(mg/L) 一、離體根培養(yǎng) 培養(yǎng)方法:一、離體根培養(yǎng)2無性系的建立和培養(yǎng)、應(yīng)用 1)將種子進(jìn)行表面消毒,在無菌條件下用濕布培養(yǎng)萌發(fā),至根伸長(zhǎng)1.0cm以上。2)從根尖一端切取長(zhǎng)1.2cm的尖端,接種于培養(yǎng)基中。3)培養(yǎng)物生長(zhǎng)甚快,幾天后發(fā)育出側(cè)根。待側(cè)根生長(zhǎng)約一周后,即切取側(cè)根的根尖進(jìn)行接種培養(yǎng),如此反復(fù),得到離體根的無性系。4)這種根可用來進(jìn)行根系生理生化和代謝方面的實(shí)驗(yàn)研究。如營(yíng)養(yǎng)選擇吸收、根尖伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、生長(zhǎng)素對(duì)伸長(zhǎng)的影響等5)培養(yǎng)條件為暗光、2527。3植株再生培養(yǎng) 第一步誘導(dǎo)形成愈傷組織。第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的分化、再分化成小植株。一、離體根培養(yǎng)2無性系的建立和培養(yǎng)
4、、應(yīng)用 二、 莖尖培養(yǎng) 概念:是切取莖尖部分或莖尖分生組織部分,進(jìn)行培養(yǎng)的過程。這是組織培養(yǎng)中用得較多的外植體。因?yàn)榍o尖分生區(qū)是三個(gè)分區(qū)的主要部分。 莖尖培養(yǎng)可分為微莖尖培養(yǎng)和普通莖尖培養(yǎng)。 1.微莖尖:指帶有1-2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)錐,其長(zhǎng)度不超過0.5mm。2.普通莖尖:指取幾mm到幾十mm長(zhǎng)的頂芽尖及側(cè)芽尖。這里主要介紹后者 特點(diǎn):技術(shù)簡(jiǎn)單,操作方便,易成活和分化,成苗時(shí)間短。 二、 莖尖培養(yǎng) 概念:是切取莖尖部分或莖尖分生組織部分, 步驟如下:1取材:挑選潔凈、無污染,生長(zhǎng)不久的莖,從植物的莖、藤或匍匐枝上切取2cm以上的頂梢。木本植物可事先對(duì)莖尖噴幾次滅菌藥劑。用于普通莖尖培養(yǎng)。2消毒
5、將采到的莖尖切成0.51.0cm長(zhǎng),并將大葉除去,休眠芽預(yù)先剝除鱗片。將莖尖置于流水沖洗干凈,再在95%的酒精中處理30秒,然后在稀釋20倍的次氯酸鈉中浸5分鐘,最后用無菌水沖洗數(shù)次,瀝干后準(zhǔn)備接種。3接種 為了減少污染,在接種前再剝掉一些幼葉,使莖尖為0.5cm大小左右。用作快速繁殖。 注意:一要防褐化。接種時(shí),不用銹刀,動(dòng)作敏捷,隨切隨接,用15%VC液浸泡處理。二要防干燥 步驟如下:1取材:挑選潔凈、無污染,生長(zhǎng)不久的莖,從4培養(yǎng) (1)培養(yǎng)基:采用MS培養(yǎng)基或略加修改,或補(bǔ)加其它物質(zhì)。也可用其它培養(yǎng)基如White,Heller等。 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素是必須的,如2,4-D,IAA,NAA等
6、,但是濃度不能太高,一般用0.1mg/L左右,若高易產(chǎn)生畸形芽或形成愈傷組織。4培養(yǎng) (1)培養(yǎng)基:采用MS培養(yǎng)基或略加修改,或補(bǔ)加其(2)培養(yǎng)問題處理: 莖尖在培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)太慢、生長(zhǎng)太快和生長(zhǎng)正常等三種類型。 I 生長(zhǎng)太慢:接種后莖尖不增大,只是莖尖逐漸變綠,出現(xiàn)綠色小點(diǎn),細(xì)胞逐漸老化而進(jìn)入休眠狀態(tài),或者逐漸變褐死亡。引起原因的是生長(zhǎng)素濃度太低,或是溫度過低或過高。(2)培養(yǎng)問題處理: 莖尖在培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)太慢、生長(zhǎng)(2)培養(yǎng)問題處理:II 生長(zhǎng)太快型:是接種后莖尖迅速增大,在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織,并迅速增殖,而莖尖不伸長(zhǎng),久之莖尖也形成愈傷組織,從而喪失發(fā)育成苗的能力。引起原
7、因一是生長(zhǎng)素濃度過高,引起細(xì)胞瘋狂分裂而導(dǎo)致愈傷組織的形成。二是光照太弱或溫度太高。(2)培養(yǎng)問題處理:II 生長(zhǎng)太快型:是接種后莖尖迅速增大,(2)培養(yǎng)問題處理:III 生長(zhǎng)正常型是接種后莖尖基部稍增大并形成少量愈傷組織,莖尖顏色逐漸變綠,并逐漸伸長(zhǎng),葉原基發(fā)育成可見的小葉,進(jìn)而形成小苗。(2)培養(yǎng)問題處理:III 生長(zhǎng)正常型是接種后莖尖基部稍增大(3)培養(yǎng)條件:培養(yǎng)時(shí)每天光照可長(zhǎng)一些,最長(zhǎng)達(dá)16h/d,照度1500-3000Lx,溫度252。并且根據(jù)不同植物種類,或者隨培養(yǎng)過程的不同,給予適當(dāng)?shù)臅円箿夭畹忍幚?。注意:防培養(yǎng)基干燥,由于莖尖培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),通過定期轉(zhuǎn)移、嚴(yán)加封口等。一般莖尖培養(yǎng)
8、在天左右可直接長(zhǎng)成新梢。(3)培養(yǎng)條件:培養(yǎng)時(shí)每天光照可長(zhǎng)一些,最長(zhǎng)達(dá)16h/d,照(4)繼代培養(yǎng)用莖段切割法。 繼代培養(yǎng)可用MS0培養(yǎng)基?;蛴蒙L(zhǎng)物質(zhì)較低的MS培養(yǎng)基。 也可邊增殖邊生根培養(yǎng)(4)繼代培養(yǎng)用莖段切割法。(5)誘導(dǎo)生根I) 用1/2 MS培養(yǎng)基, 并只加入生長(zhǎng)素類調(diào)節(jié)物質(zhì),如NAA 、IBA等。注意濃度II)也可將切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液處理48小時(shí),然后轉(zhuǎn)移到無激素的生根培養(yǎng)基中。III)注意較高濃度的生長(zhǎng)素對(duì)生根有抑制作用。(5)誘導(dǎo)生根5.移栽馴化 指標(biāo):發(fā)現(xiàn)新梢基部生有較濃密的不定根,生長(zhǎng)健壯而發(fā)達(dá),長(zhǎng)度在1cm以內(nèi)。 移栽:可先進(jìn)行幾天煉苗程,
9、取出洗培養(yǎng)基栽入馴化器皿基質(zhì)蛭石:珍珠巖:草炭土為1:1:0.5。 栽后管理:1)初期保持濕度?;|(zhì)澆透水,床面澆濕,搭小拱棚等,并且初期要常噴霧處理。 2)后期逐漸減少濕度。拱棚兩端打開通風(fēng),減少噴水次數(shù)。以后揭去拱棚,并控制水分。 溫度管理上要掌握適宜的生根溫度,最適宜的溫度是1620,春季地溫較低時(shí),可用電熱線來加溫。 光照:初期弱光照,加蓋遮陽網(wǎng)或報(bào)紙等,后期可直接利用自然光照。5.移栽馴化移栽前的工作(1)培養(yǎng)瓶生壯苗 加入生長(zhǎng)控制劑,如多效唑, B9, CCC,其作用是使苗粗壯,葉綠素增加。移栽前的工作(1)培養(yǎng)瓶生壯苗(2)煉苗 將瓶蓋打開,打破無菌環(huán)境,濕度逐漸下降,光照逐漸加
10、強(qiáng),使之形成新的功能強(qiáng)的根和葉片。一般煉苗時(shí)間為1030D。(2)煉苗移栽時(shí)應(yīng)注意的問題 (1)防止菌類滋生 苗底部培養(yǎng)基要洗干凈 殺菌劑處理苗的根部 定時(shí)用殺菌劑處理種植基質(zhì)常用殺菌劑:KMnO4、百菌清、多菌靈、托不津,使用濃度0.1移栽時(shí)應(yīng)注意的問題 (1)防止菌類滋生(2)保持小苗水分供給平衡 (2)保持小苗水分供給平衡 (3)移栽時(shí)選擇合理的種植基質(zhì) 基質(zhì)要疏松透氣,有適宜的保水性,易于滅菌處理,不利于雜菌滋生:常用珍珠巖,椰糠,蛭石,細(xì)沙,泥炭。泥炭 珍珠巖 椰糠(3)移栽時(shí)選擇合理的種植基質(zhì)泥炭 (4)注意一定光照,溫度條件 一般強(qiáng)度較高的慢射光較好(4)注意一定光照,溫度條件三
11、、 莖段培養(yǎng) 概念:指不帶芽和帶1個(gè)以上定芽的,包括塊莖、球莖在內(nèi)的幼莖切段的無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)目的:快速繁殖。也可研究莖細(xì)胞的生理,以及篩選突變體育種??旆眱?yōu)點(diǎn):培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單易行,繁殖速度較快;芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好,且無病,性狀均一;解決不能用種子繁殖植物的快速繁殖問題等。三、 莖段培養(yǎng) 概念:指不帶芽和帶1個(gè)以上定芽的,包括塊莖、1.材料選擇和處理 取生長(zhǎng)健壯無病蟲的幼嫩枝條或鱗莖盤,木本則取當(dāng)年生嫩枝或一年生枝條,剪去葉片,剪成34cm的小段。 注意:1)盡力取頂部莖切段和頂芽,但由于頂芽少可利用腋芽,但盡力用莖上部的腋芽。 2)盡量在生長(zhǎng)期取芽,休眠期成活率降低。如蘋果在36月取材的
12、成活率為60%,711月下降到10%,122月都在10%以下。 1.材料選擇和處理 取生長(zhǎng)健壯無病蟲的幼嫩枝條或鱗莖盤,木本1.材料選擇和處理 在自來水中沖洗13小時(shí),用75%酒精滅菌3060秒,再用0.1%升汞浸泡38分鐘,或用飽和漂白粉浸泡1020分鐘,因材料老嫩和蠟質(zhì)多少而定時(shí)間。最后用無菌水沖洗數(shù)次,以備接種。 1.材料選擇和處理 在自來水中沖洗13小時(shí),用2培養(yǎng)過程 培養(yǎng)選MS培養(yǎng)基,加入3%蔗糖,用0.7%的瓊脂固化。培養(yǎng)條件保持25左右,給予充分的光照和光期。培養(yǎng)物的變化:1)基部切口上長(zhǎng)出愈傷組織,呈現(xiàn)稍許增大,控制不要過大。2)而芽開始長(zhǎng)長(zhǎng),有時(shí)會(huì)出現(xiàn)叢生芽,培養(yǎng)方式或是培養(yǎng)
13、出芽梢或是培養(yǎng)芽叢,從而得到無菌苗。培養(yǎng)基:促進(jìn)腋芽增殖用6-BA是最為有效的,依次為Kt和Zt等。生長(zhǎng)素雖不能促進(jìn)腋芽增殖,但可改善苗的生長(zhǎng),也要適量加入。GA對(duì)芽伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用。2培養(yǎng)過程 培養(yǎng)選MS培養(yǎng)基,加入3%蔗糖,用0.7%的瓊2培養(yǎng)過程繼代擴(kuò)繁:包括二種途徑,一是促進(jìn)腋芽的快速生長(zhǎng);二是誘導(dǎo)形成大量不定芽。第一種途徑的好處是不會(huì)產(chǎn)生變異,能保持品種優(yōu)良特性。且方法簡(jiǎn)便,可在各種植物上使用,每年從一個(gè)芽可增殖10萬株以上。第二種途徑雖會(huì)產(chǎn)生變異,繁殖系數(shù)較高,適于多數(shù)植物。生根培養(yǎng)和移栽馴化與莖尖培養(yǎng)相似,不再重復(fù)。同樣注意馴化管理。要進(jìn)行煉苗,小心移栽,初期濕度要大,基質(zhì)通氣濕潤(rùn)
14、,保濕保溫,特別要精心管理等。2培養(yǎng)過程繼代擴(kuò)繁:包括二種途徑,一是促進(jìn)腋芽的快速生長(zhǎng);四、 離體葉培養(yǎng) 離體葉培養(yǎng):包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉在內(nèi)的葉組織的無菌培養(yǎng)。它大多經(jīng)脫分化形成愈傷組織,再經(jīng)再分化生出不定芽和不定根。應(yīng)用:不僅可用于研究形態(tài)建成、光合作用、葉綠素形成等理論問題,而且也是繁殖稀有名貴品種的有效手段 四、 離體葉培養(yǎng) 離體葉培養(yǎng):包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、四、 離體葉培養(yǎng)葉培養(yǎng)特點(diǎn):材料來源廣泛,數(shù)量大,容易培養(yǎng),尤其對(duì)木本植物,生成的愈傷組織完整,數(shù)量多,較迅速等。 葉片再生能力: 以羊齒植物最多,雙子葉植物次之,單子葉植物最少。 再生方式:一種是直接誘導(dǎo)形
15、成不定芽,另一種是先誘導(dǎo)形成愈傷組織,再經(jīng)愈傷組織分化成植株。 四、 離體葉培養(yǎng)葉培養(yǎng)特點(diǎn):材料來源廣泛,數(shù)量大,容易培養(yǎng),葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下: 材料選擇及滅菌 選擇健康潔凈的植株,取其較幼嫩葉片,沖洗干凈,用70%酒精漂洗約10秒,再在飽和漂白粉液中浸315分鐘,或在0.1%升汞中浸35分鐘,以前者為佳。用無菌水沖洗數(shù)次,再放在無菌的干濾紙上吸干水分,以供接種用。對(duì)一些粗糙或帶茸毛的葉片要延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。注意要選擇成熟的葉片。 葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下: 材料選擇及滅菌 選擇健康潔葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下: .接種 將葉片切成約0.5cm見方小塊或圓片及薄片(如葉柄和子葉),注意選擇切塊位置。MS培
16、養(yǎng)基附加BA13,NAA0.251。 3.培養(yǎng) 培養(yǎng)條件為每天1012小時(shí)光照,光強(qiáng)15003000Lx。 葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下: .接種 將葉片切成約0.5c3.培養(yǎng) 1)培養(yǎng)24周,葉切塊開始增厚腫大,進(jìn)而形成愈傷組織。 2)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),其培養(yǎng)基的BA含量為2左右,約再過10天左右,愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠出現(xiàn)綠色芽點(diǎn),形成不定芽。通過繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng),完成整個(gè)組培過程。 3.培養(yǎng) 1)培養(yǎng)24周,葉切塊開始增厚腫大,進(jìn)而形3.培養(yǎng)葉的培養(yǎng)比胚,莖尖和莖段培養(yǎng)難度大。首先要選用易培養(yǎng)成功的葉組織,如幼葉比成熟葉易培養(yǎng),子葉比葉片易培養(yǎng)。其次要添加適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度,保證
17、利于葉組織的脫分化和再分化。3.培養(yǎng)葉的培養(yǎng)比胚,莖尖和莖段培養(yǎng)難度大。首先要選用易培養(yǎng)第二節(jié)生殖器官培養(yǎng)一、 花器官和種子培養(yǎng)(一)花器官培養(yǎng) 花器官培養(yǎng): 指整個(gè)花器及其組成部分如花托、花瓣、花絲、花柄、子房、花藥等的無菌培養(yǎng)。子房和花藥培養(yǎng)另有專門敘述。 應(yīng)用:理論上通過離體花芽培養(yǎng)可了解整體植物和內(nèi)源激素在花芽性別決定中所起的作用??梢粤私饣ㄆ鞲鞑糠謱?duì)果實(shí)和種子發(fā)育的作用,以及內(nèi)、外源激素在果實(shí)種子發(fā)育過程中的調(diào)控作用。生產(chǎn)上可用于珍貴品種的擴(kuò)大繁殖。 第二節(jié)生殖器官培養(yǎng)一、 花器官和種子培養(yǎng)培養(yǎng)方法如下: 1取材 從健壯植株上取未開放的花蕾,已經(jīng)開花的不宜用,因?yàn)橄纠щy。先用75%
18、酒精消毒約30秒鐘,再用飽和漂白粉浸1015分鐘,取出用無菌水沖洗數(shù)次。 2接種培養(yǎng) 用整個(gè)花蕾培養(yǎng)時(shí),只要把花梗插入培養(yǎng)基中。若用花器,則分別取下切成小片。培養(yǎng)方法如下: 1取材 從健壯植株上取未開放的花2接種培養(yǎng) I) 培養(yǎng)基: MS、B5等。若讓花器官育成小植株,要用誘導(dǎo)培養(yǎng)基,加入生長(zhǎng)激素和細(xì)胞分裂素,先形成愈傷組織或胚狀體,再分化培養(yǎng)成植株。如菊花的花瓣片接在含6-BA 2mg/L、NAA 0.2的MS培養(yǎng)基上,形成少量愈傷組織。再經(jīng)1個(gè)月就分化出綠色芽點(diǎn),再切割轉(zhuǎn)接,可形成大量無根苗,用于繁殖。 II) 261500Lx光照,每天光照10小時(shí),培養(yǎng)約2周2接種培養(yǎng) I) 培養(yǎng)基:
19、MS、B5等。若讓花器(二)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)是指受精后發(fā)育完全的成熟種子和發(fā)育不完全的未成熟種子的無菌培養(yǎng)。這項(xiàng)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于花卉、蔬菜、果樹、農(nóng)作物等的種子培養(yǎng)之中。 優(yōu)點(diǎn):可以打破種子休眠,特別對(duì)一些休眠期長(zhǎng)的植物;可以作為大量生產(chǎn)試管苗的好材料,它分化容易,無菌操作方便??墒惯h(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的雜種敗育種子,正常萌發(fā)產(chǎn)生第二代植株。 (二)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)是指受精后發(fā)育完全的成熟種子和發(fā)育不培養(yǎng)技術(shù)如下: 1種子滅菌 種皮厚或不飽滿的種子,宜用0.1%升汞消毒1020分鐘。幼嫩的或發(fā)育不全的種子,宜用飽和漂白粉消毒1530分鐘。若種子上有絨毛或蠟質(zhì),應(yīng)先用95%酒精或吐溫40處理,提高消
20、毒效果。對(duì)殼厚難萌發(fā)的種子,可去殼培養(yǎng)。 培養(yǎng)技術(shù)如下: 1種子滅菌 種皮厚或不飽滿的種子,宜用0培養(yǎng)技術(shù)如下:2培養(yǎng)基 若以種子萌發(fā)為目的,培養(yǎng)基可不加或少加生長(zhǎng)激素。對(duì)某些發(fā)育不全的無胚乳的種子培養(yǎng),應(yīng)提供適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)激素。種子培養(yǎng)的糖濃度可稍低,一般13%。 3接種培養(yǎng) 種子培養(yǎng)的接種較容易,每瓶35粒,均勻排列,4.培養(yǎng)條件:2028,10002000Lx光強(qiáng),每天光照10小時(shí)培養(yǎng)技術(shù)如下:2培養(yǎng)基 若以種子萌發(fā)為目的,培養(yǎng)基可不加或二、 胚胎培養(yǎng) 胚及胚器官(如子房、胚珠)在離體無菌條件下,使胚發(fā)育成幼苗的技術(shù)。包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)等。 胚胎培養(yǎng)史:已
21、有近百年,1904年的Haning首次培養(yǎng)了蘿卜和辣椒的胚,并萌發(fā)形成小苗。30年代把蘭科植物的胚培養(yǎng)成小植株。40年代進(jìn)行蘋果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、馬鈴薯、甘藍(lán)與大白菜的種間雜種的胚胎培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)及子房與胚珠培養(yǎng)。 二、 胚胎培養(yǎng) 胚及胚器官(如子房、胚珠)在離體無菌條件下(一)胚胎培養(yǎng)的意義 1.克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性 用胚胎培養(yǎng)和試管受精技術(shù),解決種間和屬間胚敗育,胚發(fā)育不全,而不能正常萌發(fā)的問題。2.使胚發(fā)育不全的植物獲得后代。如蘭花、天麻的種子成熟時(shí),胚只有67個(gè)細(xì)胞,多數(shù)胚不能成活。分離出這此些未成熟胚進(jìn)行培養(yǎng),得到正常植物。3.縮短育種年限 應(yīng)用胚培養(yǎng)技術(shù)可以縮短育種周期1
22、2年。(一)胚胎培養(yǎng)的意義 1.克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性 用胚胎培養(yǎng)(二)離體胚培養(yǎng) 胚發(fā)育過程:受精受精卵合子第一次分裂分生組織和幼胚成熟胚。在這個(gè)過程,胚靠消耗胚乳的營(yíng)養(yǎng)而發(fā)育,同時(shí)胚處在胚囊環(huán)境中,可吸收氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)。(二)離體胚培養(yǎng) 胚發(fā)育過程:受精受精卵合子第一次分裂離體胚培養(yǎng)包括成熟胚和幼胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng) 指子葉期后至發(fā)育完全的胚。 培養(yǎng)較易成功,在含有無機(jī)大量元素和糖的培養(yǎng)基上,就能正常生長(zhǎng)成幼苗。將成熟或未成熟種子70%酒精表面消毒無菌水沖洗34次無菌條件下進(jìn)行解剖,取出胚并接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)上培養(yǎng)。幼胚培養(yǎng) 幼胚是指子葉期以前的幼小胚,現(xiàn)在可對(duì)心形期胚或更早期(0.10.2
23、mm)的胚進(jìn)行培養(yǎng)。胚越小就越難培養(yǎng),現(xiàn)在大麥、薺菜、甘蔗、甜菜、胡蘿卜等幼胚已培養(yǎng)成功。離體胚培養(yǎng)包括成熟胚和幼胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng) 指子葉期后至I)操作方法 與成熟胚培養(yǎng)基本相同,切取幼胚必須在高倍解剖鏡下進(jìn)行,操作時(shí)要特別細(xì)心,盡量取出完整的胚。 I)操作方法 與成熟胚培養(yǎng)基本相同,切取幼胚必須在高倍解剖II)培養(yǎng)方式 常見有三種明顯不同的生長(zhǎng)方式:第一種是繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育,維持“胚性生長(zhǎng)”;第二種是在培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗,而不繼續(xù)進(jìn)行胚性生長(zhǎng),通常稱為“早熟萌發(fā)”;第三種是發(fā)生細(xì)胞增殖形成愈傷組織,并由此再分化形成多個(gè)胚狀體或芽原基。特別是加有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí),就更為如此。II)培養(yǎng)方式
24、 常見有三種明顯不同的生長(zhǎng)方式:III)影響因素 1.培養(yǎng)基 成熟胚對(duì)培養(yǎng)基要求不高,而幼胚要求較高,常用的培養(yǎng)基有Tukey、MS、B5、Nitsch培養(yǎng)基,其中前者適于成熟胚培養(yǎng),其它適于未成熟胚和幼胚培養(yǎng)。 幼胚需要較高的蔗糖濃度,提供較高的滲透壓。由于幼胚在自然條件下賴以生存的是無定形的液體胚乳,具有較高的滲透壓,人工培養(yǎng)基中要?jiǎng)?chuàng)造高滲透壓的條件,它可以調(diào)節(jié)胚的生長(zhǎng),阻止可能的滲透壓影響,還能抑制早熟萌發(fā)中的細(xì)胞延長(zhǎng),以及抑制胚的萌發(fā),避免把細(xì)胞的伸長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)化為分裂狀態(tài)。III)影響因素 1.培養(yǎng)基 成熟胚對(duì)培養(yǎng)基要求不高,而III)影響因素2.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) 不同植物的胚培養(yǎng)需要的生長(zhǎng)
25、物質(zhì)不同,如IAA可明顯促進(jìn)向日葵胚的生長(zhǎng)。IAA,Kt的共同作用可促進(jìn)薺菜幼胚的生長(zhǎng)。一般認(rèn)為IAA可使胚的長(zhǎng)度增加;加入BA可提高胚的生存機(jī)會(huì)。3.天然提取物 椰乳對(duì)胚培養(yǎng)有一定的促進(jìn)作用,如番茄胚在含有50%椰乳的培養(yǎng)基中可維持生長(zhǎng)。瓜類的胚乳提取物也能促進(jìn)胚生長(zhǎng)的能力,可能是植物激素的細(xì)胞分裂物質(zhì)和一些有機(jī)氮化合物作用的結(jié)果。4.溫光條件 大多數(shù)植物的胚在2530為宜,但是,早熟果樹(如桃)必須經(jīng)過一定的低溫春化階段才能正常萌發(fā)生長(zhǎng)。 光照可以促進(jìn)某些植物的胚轉(zhuǎn)綠,利于胚芽生長(zhǎng),而黑暗利于胚根生長(zhǎng)。因此以光暗交替培養(yǎng)較為有利。5.其它條件 胚培養(yǎng)中還要求較高濃度的氨基酸及無機(jī)鹽。III
26、)影響因素2.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) 不同植物的胚培養(yǎng)需要的生三、胚珠培養(yǎng) 概念:在無菌條件下對(duì)授粉的子房取出胚珠進(jìn)行培養(yǎng)的過程。有時(shí)也把胚珠連同胎座一起取下來培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn):胚珠培養(yǎng)可以解決象蘭科植物成熟胚較小不易培養(yǎng)的問題。另一方面在未受精的胚珠培養(yǎng)中,可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體,用于單倍體育種。三、胚珠培養(yǎng) 概念:在無菌條件下對(duì)授粉的子房取出胚珠進(jìn)行培養(yǎng)三、胚珠培養(yǎng)接種和培養(yǎng)基:從花中取出子房進(jìn)行表面消毒,在無菌條件下進(jìn)行解剖,取出胚珠,放在培養(yǎng)基上培養(yǎng);多用Nistch培養(yǎng)基,也可采用MS、N6、B5等培養(yǎng)基。注意:關(guān)鍵是選擇胚的發(fā)育時(shí)期,實(shí)驗(yàn)證明發(fā)育到球形胚期的胚珠較易培養(yǎng)成功。另外可取用帶胎座甚至
27、帶部分子房的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)。三、胚珠培養(yǎng)接種和培養(yǎng)基:從花中取出子房進(jìn)行表面消毒,在無菌四、胚乳培養(yǎng) 概念:指對(duì)由兩個(gè)單倍的極核和一個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的三倍體組織的培養(yǎng)??色@得無子結(jié)實(shí)的三倍體植株,進(jìn)而可將它加倍成六倍體植株。接種和培養(yǎng)基 :取授粉48天后的幼果,常規(guī)消毒后,在無菌條件下切開果實(shí),取出種子,小心分離出胚乳。接種在培養(yǎng)基上;四、胚乳培養(yǎng) 概念:指對(duì)由兩個(gè)單倍的極核和一個(gè)單倍的精子結(jié)合培養(yǎng)過程: I)接入MS、White等培養(yǎng)基,附加2,4-D或NAA 0.52.0,BA0.11.0。在2527和黑暗條件或散射光下培養(yǎng),約6-10天胚乳開始膨大,形成愈傷組織;II)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基,
28、MS培養(yǎng)基附加0.53.0 mg/l的BA及少量的NAA。使愈傷組織長(zhǎng)出芽。III)切下不定芽,插入生根培養(yǎng)基中,光下培養(yǎng)1015天,切口處可長(zhǎng)出白色的不定根。培養(yǎng)過程: I)接入MS、White等培養(yǎng)基,附加2,4-D第三節(jié) 植物器官組織培養(yǎng)常見問題及對(duì)策一、污染及控制 1、污染的含義: 指在組培過程中培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)滋生菌斑,使培養(yǎng)材料不能正常生長(zhǎng)發(fā)育,從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。2、污染原因(從病原菌分析)(1)細(xì)菌污染:菌斑呈黏粘液狀,界限比較明顯,一般接種后12天即能發(fā)現(xiàn)。主要是大腸桿菌和鏈球菌。(2)真菌污染:菌斑呈絨毛狀、絮狀,界限不明顯,伴有不同顏色的孢子接種后310天才能發(fā)現(xiàn)。主要是霉菌
29、污染。第三節(jié) 植物器官組織培養(yǎng)常見問題及對(duì)策一、污染及控制 3、污染途徑 (1)外植體帶菌(2)培養(yǎng)基及接種器具滅菌不徹底(3)接種操作時(shí)帶入(4)環(huán)境不清潔3、污染途徑 (1)外植體帶菌(2)培養(yǎng)基及接種器4、污染的預(yù)防措施 A、 防止外植體帶菌(1) 選擇好外植體采集時(shí)期和采集部位 外植體采集以春秋為宜; 優(yōu)先選擇地上部分作為外植體; 陰雨天勿采,晴天下午采集; 采前噴殺蟲劑、殺菌劑或套塑料袋。(2)室內(nèi)或無菌條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。(3)外植體嚴(yán)格滅菌 滅菌效果實(shí)驗(yàn) 多次滅菌和交替滅菌 4、污染的預(yù)防措施 A、 防止外植體帶菌(1) 選擇好B、保證培養(yǎng)基及接種器具徹底滅菌 1、分裝時(shí),注射器勿
30、觸瓶口。培養(yǎng)基勿粘瓶口2、檢查封口膜是否破損3、扎瓶口要位置適當(dāng),松緊適宜4、保證滅菌時(shí)間和高壓鍋內(nèi)溫度5、接種工具用前徹底滅菌6、工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品定期進(jìn)行濕熱滅菌 C、操作人員嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程B、保證培養(yǎng)基及接種器具徹底滅菌 1、分裝時(shí),注射器勿D、 保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔 (1)污染瓶經(jīng)高壓滅菌后再清洗(2)接種環(huán)境定期熏蒸消毒、紫外燈照射,或用臭氧滅菌機(jī)消毒(3)定期清洗或更換超凈臺(tái)初過濾器,進(jìn)行帶菌實(shí)驗(yàn);接種前1520min打開風(fēng)機(jī),風(fēng)速調(diào)整到2030m/min,并對(duì)臺(tái)面用75%酒精噴霧消毒(4)定期對(duì)培養(yǎng)室消毒,防止高溫 D、 保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔 (1)污染瓶經(jīng)高壓
31、滅菌后二、培養(yǎng)物的不良表現(xiàn)及改進(jìn)措施(一)初始培養(yǎng)階段1.培養(yǎng)物水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯可能原因:表面殺菌劑過量,消毒時(shí)間過長(zhǎng),外植體選用不當(dāng)(部位或時(shí)期)。改進(jìn)措施:調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度,縮短消毒時(shí)間,試用其他部位,生長(zhǎng)初期取材。2.培養(yǎng)物長(zhǎng)期培養(yǎng)幾乎無反應(yīng)可能原因:基本培養(yǎng)基不適宜,生長(zhǎng)素不當(dāng)或用量不足,溫度不適宜。改進(jìn)措施:更換基本培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分,尤其是調(diào)整鹽離子濃度,增加生長(zhǎng)素用量,試用2,4-D,調(diào)整培養(yǎng)溫度。 二、培養(yǎng)物的不良表現(xiàn)及改進(jìn)措施(一)初始培養(yǎng)階段1.培養(yǎng)物(一)初始培養(yǎng)階段3.愈傷組織生長(zhǎng)過旺、疏松,后期水浸狀可能原因:激素過量,溫度偏高,無機(jī)鹽含
32、量不當(dāng)。改進(jìn)措施:減少激素用量,適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度,調(diào)整無機(jī)鹽(尤其是銨鹽)含量,適當(dāng)提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度。4.愈傷組織太緊密、平滑或突起,粗厚,生長(zhǎng)緩慢可能原因:細(xì)胞分裂素用量過多,糖濃度過高,生長(zhǎng)素過量。改進(jìn)措施:減少細(xì)胞分裂素用量,調(diào)整細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例,降低糖濃度。(一)初始培養(yǎng)階段3.愈傷組織生長(zhǎng)過旺、疏松,后期水浸狀(一)初始培養(yǎng)階段5.側(cè)芽不萌發(fā),皮層過于膨大,皮孔長(zhǎng)出愈傷組織可能原因:枝條過嫩,生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素用量過多。改進(jìn)措施:減少激素用量,采用較老化枝條。 6、初代培養(yǎng)外植體的褐變 外植體褐變是指在接種后,其表面開始褐化,有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐化的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)
33、是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活,而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中,會(huì)產(chǎn)生醌類物質(zhì),它們多呈棕褐色,當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后,就會(huì)抑制其他酶的活性,從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。 (一)初始培養(yǎng)階段5.側(cè)芽不萌發(fā),皮層過于膨大,皮孔長(zhǎng)出愈傷(1)褐變的主要原因如下 植物品種 研究表明,在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶,而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此,在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇,對(duì)不同的品種分別進(jìn)行處理。 生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同,所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說,處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺,而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體,由于含醌類物質(zhì)較多,
34、因此褐變較為嚴(yán)重。一般來說,幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯,而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。 培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機(jī)鹽會(huì)使某些觀賞植物的褐變程度增加,此外,細(xì)胞分裂素的水平過高也會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性,從而使褐變現(xiàn)象加深。 培養(yǎng)條件不當(dāng) 如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)等,均可使多酚氧化酶的活性提高,從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。(1)褐變的主要原因如下 植物品種 研究表明,在不同品種(2)減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法 選擇合適的外植體 一般來說,最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體,這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。 合適的培養(yǎng)條件 無機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、及時(shí)繼代培養(yǎng)均
35、可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。使用抗氧化劑 半胱氨酸及其鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、抗壞血酸等。該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L。用經(jīng)過濾滅菌的藥液洗滌剛切割的外植體傷口表面,或加入固體培養(yǎng)基的表層,或?qū)偳懈畹耐庵搀w浸入其中一定時(shí)間。另外,使用0.1%-0.5%的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。PVP處理。 連續(xù)轉(zhuǎn)移 對(duì)容易褐變的材料可間隔1224h的培養(yǎng)后,再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上,這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d后,褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。(2)減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法 選擇合適的外植體 一般來說(二)繼代培養(yǎng)階段1.苗分化數(shù)量少、速度慢、分枝少、個(gè)別苗生長(zhǎng)細(xì)高可能原因:細(xì)胞分裂素
36、用量不足,溫度偏高,光照不足。改進(jìn)措施:增加細(xì)胞分裂素用量,適當(dāng)降低溫度,改善光照,改單芽繼代為團(tuán)塊(叢芽)繼代。 2.苗分化過多,生長(zhǎng)慢,有畸形苗,節(jié)間極短,苗叢密集,微型化??赡茉颍杭?xì)胞分裂素用量過多,溫度不適宜。改進(jìn)措施:減少或停用細(xì)胞分裂素一段時(shí)間,調(diào)節(jié)溫度。 (二)繼代培養(yǎng)階段1.苗分化數(shù)量少、速度慢、分枝少、個(gè)別苗生(二)繼代培養(yǎng)階段3.分化率低,畸形,培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)苗再次愈傷組織化可能原因:生長(zhǎng)素用量偏高,溫度偏高。改進(jìn)措施:減少生長(zhǎng)素用量,適當(dāng)降溫。4.葉粗厚變脆可能原因:生長(zhǎng)素用量偏高,或兼有細(xì)胞分裂素用量偏高。改進(jìn)措施:適當(dāng)減少激素用量,避免葉片接觸培養(yǎng)基 5.再生苗的葉緣
37、、葉面等外偶有不定芽分化出來可能原因:細(xì)胞分裂素用量偏高,或表明該種植物適于該種再生方式。改進(jìn)措施:適當(dāng)減少細(xì)胞分裂素用量,或分階段地利用這一再生方式 (二)繼代培養(yǎng)階段3.分化率低,畸形,培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)苗再次愈傷(二)繼代培養(yǎng)階段6.叢生苗過于細(xì)弱,不適于生根或移栽可能原因:細(xì)胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當(dāng),溫度過高,光照短,光強(qiáng)不足,久不轉(zhuǎn)移,生長(zhǎng)空間窄。改進(jìn)措施:減少細(xì)胞分裂素用量,免用赤霉素,延長(zhǎng)光照時(shí)間,增強(qiáng)光照,及時(shí)轉(zhuǎn)接,降低接種密度。 7.幼苗淡綠,部分失綠可能原因:無機(jī)鹽含量不足,PH值不適宜,鐵、錳、鎂等缺少或比例失調(diào),光照、溫度不適。改進(jìn)措施:針對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素虧缺情況調(diào)整培養(yǎng)基
38、,調(diào)好PH值,調(diào)控溫度、光照。8.幼苗生長(zhǎng)無力、發(fā)黃落葉、有黃葉、死苗夾于叢生苗中可能原因:瓶?jī)?nèi)氣體狀況惡化,PH值變化過大,久不轉(zhuǎn)接導(dǎo)致糖已耗盡,營(yíng)養(yǎng)元素虧缺失調(diào),溫度不適,激素配比不當(dāng)、缺鐵等。改進(jìn)措施:及時(shí)轉(zhuǎn)接、降低接種密度,調(diào)整激素配比和營(yíng)養(yǎng)元素濃度,改善瓶?jī)?nèi)氣體狀況,控制溫度。 (二)繼代培養(yǎng)階段6.叢生苗過于細(xì)弱,不適于生根或移栽(二)繼代培養(yǎng)階段9、繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃實(shí)踐表明,當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí),有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水漬狀,這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會(huì)使試管苗生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。 因?yàn)槌霈F(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根,因此,使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間,試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí),也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì),能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。 (二)繼代培養(yǎng)階段9、繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃(二)繼代培養(yǎng)階段呈現(xiàn)玻璃化的試管苗,其莖、葉表面無蠟質(zhì),體內(nèi)的極性化合物水平較高,細(xì)胞持水力差,植株蒸騰作用強(qiáng),無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高,透氣性較差造成的, (二)繼
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