酶工程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶PPT

1、關于酶工程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) 酶生物合成及調節(jié)一、酶的生物合成 遺傳信息傳遞的中心法則轉錄傳遞給RNA，再由RNA 蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制復制DNARNA 第二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）RNA的生物合成-轉錄(transcription) 定義 以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。.第三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月轉錄模板 啟動子（promotor) 終止子(terminator)模板鏈（template strand）反意義鏈(antisense s

2、trand)編碼鏈 (coding strand)有意義鏈(sense strand)DNA5533反意義鏈:指導轉錄作用的一條DNA鏈有意義鏈:無轉錄功能的一條DNA鏈.第四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶有意義鏈反意義鏈RNAPPi553GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成335第五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA的轉錄過程(三步)1.起始2.延長3.終止 第六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 原核生物的RNA聚合酶(D

3、DRP)E. coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（ 2 ）起始因子第七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達基因終點延長階段53RNA 啟動子（promotor) 終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開第八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA鏈的延伸圖解35RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動方向新生RNA復鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位第九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 定義 以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，

4、合成多肽鏈的過程。（二）蛋白質的生物合成-翻譯(translation) 第十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月酪553AUGGUU UAC ACA酪氨酰- tRNA反密碼mRNA密碼與反密碼的堿基配對第十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月AUG ACA5蛋蘇UGUGUU3受 位(A位)給 位(P位)大亞基小亞基第十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 蛋白質的合成過程 （大腸桿菌） 氨基酸的活化 肽鏈合成的起始 肽鏈的延伸 肽鏈合成的終止與釋放第十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月氨基酸的活化與轉運反應式：AA + tRNA + ATP氨酰-tRNA合成酶

5、氨酰-tRNA+AMP+PPi 對于E.coli而言，肽鏈合成時的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。第十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月在核糖體上合成多肽（三階段）1、起始階段2、延伸階段3、終止階段第十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月肽鏈合成的起始階段1.mRNA與小亞基結合：形成30S-mRNA-IF3復合物2.AUG與fMet-tRNA結合： 30S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密碼子上（AUG）。3.大小亞基結合IF130S起始復合物第十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月AUG

6、ACA53AUG ACA53UACUACAUG ACA53小亞基mRNAfMet-tRNA GTP大亞基GDP+Pi受位給位fMetfMet肽鏈合成的起始階段第十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月肽鏈合成的延伸階段1.進位:氨基酰-tRNA進入受位;2.轉肽:形成肽鍵,在轉肽酶作用下,給位與 受位結合;3.移位:核蛋白體向3端移動一個密碼子的 位置,空出受位,不斷地進位、轉肽、 移位,使肽鏈延長。第十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月AUG ACA53UACfMet蘇UGUAUG ACA5UACfMet蘇UGUGUUAUG ACA5UACfMet蘇UGUGUUAUG ACA

7、5fMet蘇UGUGUU333GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始復合體進位轉肽移位Mg+K+第十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月肽鏈合成的終止階段1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結合;2.酯鍵水解,多肽釋放;3.tRNA,mRNA,大小亞基解離. 第二十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月AUG UAA5UACAUG UAA5UAC33終終AUG UAA5UAC3終53UAC終肽鏈第二十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、酶生物合成的調節(jié)定義：通過調節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調節(jié)機制，是在基因轉錄水平上進行的。意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的

8、原料和能量。第二十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 操縱子基因表達的協(xié)同單位操縱子結構基因（編碼蛋白質, structural gene, S）控制部位操縱基因（operator gene, O）啟動子（promotor gene, P）（一）基因調控理論 Jacob and Monod的操縱子學說（operon theory） 第二十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月基因操縱子調節(jié)系統(tǒng)示意圖 調節(jié)基因 啟動基因 操縱基因 結構基因 DNA 轉錄 （-） RNA聚合酶 （+） 轉錄 翻譯 mRNA 翻譯 阻遏蛋白 蛋白質 誘導劑 控制區(qū) 信息區(qū)操縱子第二十四張，PPT共六

9、十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 調節(jié)基因(regulator gene)： 可產(chǎn)生一種組成型調節(jié)蛋白(regulatory protein) （一種變構蛋白），通過與效應物(effector) （包括誘導物和輔阻遏物）的特異結合而發(fā)生變構作用，從而改變它與操縱基因的結合力。 調節(jié)基因常位于調控區(qū)的上游。第二十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 cAMP-CRP復合物的作用示意圖 啟動基因（promotor gene）（啟動子）： 有兩個位點： （1）RNA聚合酶的結合位點（2）cAMP-CAP的結合位點。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolite gene activato

10、r protein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP復合物結合到啟動子的位點上，RNA聚合酶才能結合到其在啟動子的位點上，酶的合成才能開始。 第二十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月操縱基因（Operater gene）: 位于啟動基因和結構基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調節(jié)基因產(chǎn)生的變構蛋白結合，操縱酶合成的時機與速度。結構基因（Structural gene）: 決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對應關系，其中的遺傳信息可轉錄為mRNA，再翻譯為蛋白質。第二十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月

11、(二) 酶合成調節(jié)的類型 1.誘導 (induction) 組成酶：細胞固有的酶類。 誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似 物而臨時合成的一類酶。 2.阻遏 (repression) 分解代謝物阻遏(catabolite repression) 反饋阻遏(feedback repression)第二十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）酶合成的調節(jié)機制 1. 酶合成的誘導加進某種物質，使酶生物合成開始或加速進行。 酶合成誘導的現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內無上述三種酶

12、合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內有上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟原則：需要時才合成。第二十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月調節(jié)基因操縱基因乳糖結構基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白（有活性）基 因 關 閉啟動子ORPLacZLacYLaca調節(jié)基因操縱基因乳糖結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白（無活性） 基 因 表達mRNAA、乳糖操縱子的結構B、乳糖酶的誘導 乳糖 阻遏蛋白（有活性）誘導第三十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.末端產(chǎn)物阻遏 由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的

13、現(xiàn)象： 實驗： （1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時， 檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟原則:不需要就不合成。第三十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 色氨酸操縱子酶的阻遏調節(jié)基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達調節(jié)基因操縱基因結構基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結合，使之構象發(fā)生變化與操縱基因結合，結構基因不能表達 第三十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3.分解代謝物阻遏指

14、細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。第三十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 實驗：細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象”(diauxie或biphasic growth）。 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。

15、此調節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。第三十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基 因 表達CAP基因結構基因TCAPOCAP結合部位 RNA聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)第三十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三、提高酶產(chǎn)量

16、的策略（一）菌種選育（一勞永逸） 1.誘變育種 (1) 使誘導型變?yōu)榻M成型選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?2. 基因工程育種 第三十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）條件控制1. 添加誘導物 酶的底物類似物最有效。2. 降低阻遏物濃度 除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏 添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑 避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏 避免培養(yǎng)基過于豐富 添加一定量的cAMP第三十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3.添加表面活性劑 離子型 對細胞有毒害作用表面活性劑 Tween80 非離子型 增加細胞通透性 TritonX1004. 添加產(chǎn)酶促進劑第三十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)

17、作于2022年6月 第二節(jié) 酶發(fā)酵動力學 一、細胞生長的階段 在分批培養(yǎng)(batch culture)過程中，細胞生長一般要經(jīng)歷調整期、生長期、平衡期和衰亡期4個階段。第三十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞生長曲線 O-A 調整期 A-B生長期 B-D 平衡期 D-E 衰亡期 第四十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、產(chǎn)酶動力學 （一） 酶生物合成的模式 根據(jù)酶的合成與細胞生長之間的關系，可將酶的生物合成分為4種模式，即： 同步合成型 生長偶聯(lián)型 中期合成型 部分生長偶聯(lián)型延續(xù)合成型 非生長偶聯(lián)型 滯后合成型第四十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月1.同步

18、合成型 酶的生物合成與細胞生長同步。特點：酶的合成可以誘導，但不受分解代謝物阻遏和反應產(chǎn)物阻遏。 當去除誘導物、細胞進入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對應的mRNA很不穩(wěn)定。第四十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.中期合成型生長偶聯(lián)型中的特殊形式酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：酶的合成受產(chǎn)物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏。 所對應的mRNA是不穩(wěn)定的。 枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線 第四十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3.延續(xù)合成型（又稱部分生長偶聯(lián)型） 酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期

19、后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。特點：可受誘導，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。 所對應的mRNA相當穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線第四十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4.滯后合成型（又稱非生長偶聯(lián)型） 只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物的阻遏作用。 所對應的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線 第四十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月總結：影響酶生物合成模式的主要因素 高：可在細胞停止生長后繼 1）mRNA的穩(wěn)定性 續(xù)合成酶 差：隨著細胞停止生長而終 止酶的合成 2）培養(yǎng)基中阻遏物的存

20、在 不受阻遏：隨著細胞的生長而開始酶的合成。 受阻遏：細胞生長一段時間或平衡期后，酶才開始 合成。第四十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細胞開始生長就有酶的產(chǎn)生，直至細胞生長進入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。 對于：同步合成型：提高對應的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵 溫度 。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使 酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方 面努力。第四十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月(二) 產(chǎn)酶動力學一般產(chǎn)酶動力學方程可表達為：式中

21、 X細胞濃度(g /L) 細胞比生長速率(h-1) 生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g) 非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh) E酶濃度(IU/L) t時間(h)第四十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型 非生長偶聯(lián)型 第四十九張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 一.微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法 1.固體培養(yǎng):特別適合于霉菌培養(yǎng) 2.液體深層發(fā)酵:目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式 3.固定化細胞:需要特殊的固定化細胞反應器 第三節(jié) 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第五十張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二.微生物酶的類型 1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纖維素酶、果膠酶

22、），是微生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到細胞外的，即使胞外濃度很高，胞內也能維持較低水平，受到的調節(jié)控制少。 2.胞內酶：指合成后仍留在細胞內發(fā)揮作用的酶，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調控。第五十一張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三、產(chǎn)酶微生物的分離和選育 1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應具備的條件 （1）酶產(chǎn)量高 （2）易培養(yǎng)（生長速率高、營養(yǎng)要求低） （3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化 （4）易分離提純 （5）安全可靠（不是致病菌）第五十二張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.常用的產(chǎn)酶微生物 細菌：大腸桿菌；枯草芽胞桿菌 放線菌：鏈霉菌 霉菌：黑曲霉；米曲霉；根霉；木霉，青霉 酵母

23、：啤酒酵母；假絲酵母第五十三張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 產(chǎn)酶微生物的分離和篩選 1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場所采集樣品 2)富集培養(yǎng): 投其所好，取其所抗 3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pure culture）。 4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。 5)復篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質為主。 第五十四張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 -淀粉酶的篩選第五十五張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法應用含酪蛋白的培養(yǎng)基第五十六張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程 四、發(fā)酵工藝第五十七張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞活化與擴大培養(yǎng)1.保藏2.活化3.擴大培養(yǎng)基配制1.碳源主要從營養(yǎng)要求和代謝調節(jié)方面考慮碳源的選擇2.氮源 有機氮源 無機氮源3.無機鹽4.生長因素第五十八張，PPT共六十六頁，創(chuàng)作于2022年6月pH控制不同細胞，最適pH不同細胞