2010CB912400-基于冷凍電子顯微鏡學的生物大分子的高時空分辨率的結構和功能研究-修正版

1、修正版項目名稱：基于冷凍電子顯微鏡學的生物大分子的高時空分辨率的結構和功能研究首席科學家： 高海嘯清華大學起止年限：2010年1月-2014年8月依托部門：教育部一、研究內容本項目將進行以下幾個方面的研究：課題一，高通量、全自動化的冷凍電鏡數據采集和三維重構圖像處理方法的研 究a.開發(fā)高通量、全自動化的電鏡數據采集和處理方法，以及高性能的三維重構算法在冷凍電鏡結構解析工作中，目前有相當大的一部分時間和人工都消耗在重 復性工作中，例如電鏡膠片的拍攝和掃描，電鏡圖像的預篩選，三維重構計算中 的某些步驟等。近年來，隨著冷凍電子顯微學的蓬勃發(fā)展， 可以達到的分辨率越 來越高，相應地對電鏡數據量的需求也

2、越來越大。以核糖體結構解析為例，獲得10?分辨率的核糖體結構需要10萬個冷凍電鏡單顆粒。而在理論上，獲得原子 分辨率（好于3?）則至少需要100萬個單顆粒電鏡圖像。如果以目前普遍使用 的手動方式來進行數據采集和處理， 那么僅僅電鏡膠片的拍攝、掃描，以及電鏡 圖像的預篩選等工作就需要數月之久！這實際上已經成為阻礙當前高分辨率的冷 凍電鏡結構解析的主要瓶頸之一。解決這一問題的有效途徑就是開發(fā)高通量、全 自動化的電鏡數據采集和處理方法以及高性能的三維重構算法，以最大程度地提高對超大電鏡數據量的采集和處理的效率，減少在這些方面耗費的人工和時間。自動化的電鏡數據采集系統對電鏡的穩(wěn)定性和計算機控制下的可操

3、作性要 求很高。特別是開發(fā)基于單顆粒重構方法的自動化采集系統，要求能夠自動識別大量的適合成像的樣品區(qū)域并長時間持續(xù)監(jiān)控。由于開發(fā)難度很高，目前國際上在這一前沿領域的工作才剛剛開始，而真正能夠實現全自動化數據采集的系統更 是屈指可數。由本項目研究人員雷建林教授在過去數年中主持開發(fā)的 AutoEMation是其中的佼佼者。與傳統的手工采集方法相比，AutoEMation的巨大優(yōu)勢是能夠對單個樣品進行長達數日甚至數周的持續(xù)數據采集。以多輸出通道的4kx4k CCD相機為例，24小時內可至少收集2000張電鏡照片，比手工采集效 率高十倍以上。止匕外，AutoEMation還能自動地在低電子輻照劑量下根

4、據樣品情 況選擇在同一個孔洞中的不同區(qū)域多次拍攝，從而大大提高了樣品的利用率。而這在手工電鏡數據采集中是無法做到的。AutoEMation目前已經在哥倫比亞大學、德州大學休斯頓醫(yī)學中心、哈佛大學等多家冷凍電鏡研究機構全面運轉或試運轉，并已多次穩(wěn)定地對單個樣品進行數據采集一周以上，迄今共收集十余萬張CCD照片。在本課題中，我們將在AutoEMation現有的核心構架的基礎上，開發(fā)一套完 備的高通量和全自動化的電鏡數據采集和處理系統。首先，針對目前 AutoEMation還只能運行在美國FEI公司的Tecnai系列冷凍電鏡上的限制，將其 擴展到我們剛剛在清華大學和中科院生物物理所購置的Titan

5、Krios冷凍電鏡平臺上。需要指出的是，目前還沒有任何針對Titan Krios冷凍電鏡的自動化數據采 集系統。我們在這方面的工作將是國際上最前沿的。其次，將AutoEMation擴展至具有支持單顆粒采集，傾轉系列數據采集(包括電子斷層分析和單顆粒傾轉) 等多項重要冷凍電鏡操作功能。最后，在自動化數據采集的基礎上，實現對電鏡 數據的預處理、預篩選，并由此探索和優(yōu)化電鏡樣品的理想處理和數據收集條件， 如包埋冰層的最佳厚度、電子束的最佳輻照強度和最佳欠焦范圍等。冷凍電鏡圖像的三維重構有很高的計算需求，特別是其中alignment和re巾nement的計算部。在10年前，這些計算任務主要是在具有共享

6、內存架構和多 處理器的專用計算機上完成。隨著對分辨率的要求越來越高，所需要處理的電鏡 圖像的數量呈指數增長趨勢。因此，過去那種依賴于昂貴的專用計算機的數據處 理方式已不再可行，而需要采用以 LINUX為操作系統的計算機集群。在本課題 中，我們將會針對高性能并行化這一需求對相關三維重構算法進行優(yōu)化。以目前在國際冷凍電鏡領域應用最廣泛的三維重構系統SPIDER (System for ProcessingImage Data from Electron microscopy and Related fields ) 為核心，開發(fā)自動化的 電鏡數據處理系統。并將利用數據庫集中管理從樣品制備、電鏡數據

7、采集、數據分析、一直到三維重構的全套過程，以實現對一個完整的電鏡結構解析項目的高 效管理和處理。b.開發(fā)和優(yōu)化結構不均一性存在條件下的高性能分類方法，并應用于研究生物大分子復合體的動態(tài)過程和功能結構不均一性是指由于生物大分子復合體自身結構的內在靈活性， 在采集到 的同一組冷凍電鏡數據中經常包含著它們不同的結構構象。 目前，結構不均一性 影響冷凍電鏡結構的分辨率已是一個普遍存在的問題。 這主要是由于生物大分子 復合體往往有多個與功能相關的結構共存，通過實驗手段很難將它們分離。因而 在采集到的冷凍電鏡照片中，不同的單顆?？赡艽聿煌墓δ軕B(tài)結構， 它們之 間結構的差異將直接降低三維重構密度圖的分辨

8、率。在嚴重情況下，甚至會導致 局部密度圖殘缺。當前，冷凍電子顯微學領域的一個重要研究熱點就是針對結構不均一性的成熟的、普適的分類方法的研發(fā)。利用冷凍電鏡數據中豐富的內在結構信息，將存在結構不均一性的冷凍電鏡數據在三維重構前進行分類。目前采用的分類方法主要分為兩類，即監(jiān)督性方法和非監(jiān)督性方法。前者的特點是快速、簡便，但是必 須引入合適的參考結構(reference volume)。分類結果的優(yōu)劣往往取決于參考結 構選取的好壞。在冷凍電子顯微學領域，現有的分類方法的研究工作大都屬于這 一類，主要是基于交叉關聯函數的監(jiān)督性分類方法。由于監(jiān)督性分類方法對預先引入的參照結構要求較高，在使用不當的情況下常

9、常會導致分類后的結構出現偏 差甚至錯誤，因此開發(fā)有效的非監(jiān)督性分類方法來解決冷凍電鏡中的生物大分子 結構不均一性尤為重要。然而，由于冷凍電鏡數據的信噪比極低， 加之采集到的 電鏡照片中的單顆粒的投影方向有待確定，使得分類問題變得非常復雜。目前， 針對非監(jiān)督性分類方法的研究工作大多還只是在嘗試階段。其中，由本課題負責人高海嘯教授參與開發(fā)的基于最大似然法的分類方法，是目前唯一一個在實踐中得到運用的非監(jiān)督性分類方法。在本課題中，我們將在過去的分類方法的研究工 作基礎上，針對性地選擇具體的生物大分子復合體作為研究體系，通過提高和完善現有的監(jiān)督性和非監(jiān)督性方法的獨立性和普適性，包括改善已有監(jiān)督性方法對

10、參照對象的過度依賴，建立有效的分類檢驗算法等，進一步嘗試開發(fā)全新高效的 冷凍電鏡數據分類方法。課題二，低對稱或非對稱性的生物大分子復合體的高分辨結構及其動態(tài)過程的 研究細胞中所有的重大生命過程都離不開生物大分子的參與 。生物大分子發(fā)揮功 能需要其它生物分子的協同作用，形成穩(wěn)定的或者不穩(wěn)定過渡態(tài)的復合體。這些 大分子復合體通常都處于一個動態(tài)的變化過程，為它們的高分辨結構的解析帶來 了很大困難。本課題將在課題一的基礎之上，利用單顆粒重構技術解析幾類與重大生命過程相關的生物大分子復合體的高分辨結構，包括一些細胞內可溶的大分 子復合體（如核糖體）、膜蛋白或者與膜相關聯的蛋白、以及與人類疾病和健康 密切

11、相關的細胞膜上受體與配基復合物（如細胞因子 /受體復合物）。a.細胞內可溶性生物大分子復合體（核糖體等）的結構和功能的研究冷凍電子顯微學在分子機器的研究中已經應用得非常廣泛。以 DNA到蛋白 質的過程為例，從DNA的復制、轉錄、mRNA的剪切、以至蛋白質的合成這一 系列連續(xù)的遺傳信息傳遞過程中，冷凍電子顯微學都有著重要的貢獻。例如，真 核細胞的 DNA Polymerase epsilon complex 和 MCM helicase, transcriptional complex, spliceosome都已經有中等分辨率（1-3nm）的冷凍電鏡結構。我們將 會以核糖體的高分辨功能態(tài)結構為

12、重點，同時展開對細胞中其它的一些重要分子 機器的結構解析，如蛋白酶體和各種分子伴侶復合體等。自2000年核糖體的大小亞基分別被解析以來，在過去的十年中，核糖體的 晶體學研究取得了巨大的進展。迄今已經有E.coli和T. thermophilus的兩個原子 分辨率的70S核糖體被解析。盡管這些晶體結構提供了豐富的核糖體結構信息， 目前對詳細的蛋白合成分子機理卻仍未完全清楚。這主要是由于蛋白質翻譯是一 個高度動態(tài)的過程，每一步都有許多蛋白翻譯因子參與并與核糖體相互作用。迄 今為止，只有RF1、RF2和RRF這三個因子和核糖體所形成的復合體的晶體結 構被解析。與之形成對照的是，冷凍電子顯微學已經成功

13、解析出原核細胞的核糖 體和所有翻譯因子形成的各種復合體的三維結構，其中分辨率最高的已達到 6.7?。這些冷凍電鏡結構不僅大大地豐富了我們對蛋白合成的動態(tài)過程的理解， 而且通過將核糖體高分辨的晶體結構嵌入”到這些不同功能態(tài)下的電鏡三維重構圖中，還可以構建出一系列準原子分辨率的功能態(tài)結構模型。我們擬從以下幾個方面開展針對核糖體的結構和功能的研究：（1）建立一個高效的、受控的核糖體體外轉錄體系。分離純化核糖體的大小亞基以及所有翻譯 因子，在體外模擬體內的翻譯過程，精確控制核糖體復合體停留在指定的功能 態(tài)，為下一步的冷凍電鏡結構解析提供優(yōu)質樣品。并在這一系統的基礎上，采用 生物化學的方法研究蛋白翻譯過

14、程中幾個懸而未決的問題，比如在延伸過程中， EF-G是如何促進核糖體上的構象變化；GTP水解的作用到底是什么等。（2）核糖體的多種功能態(tài)的高分辨結構解析。在課題一的研究基礎上，采用高通量的冷 凍電鏡方法，解析高分辨率的核糖體的多種功能態(tài)結構，然后通過分子動力學手 段，構建準原子分辨率的各種功能態(tài)模型，從而揭示蛋白質翻譯步驟中的分子機 理。（3）核糖體的生物起源過程的相關功能和結構研究，如原核生物核糖體的組 裝過程中的一系列的酶催化反應。在這些反應中，大小亞基前體中的rRNA被修剪和修飾。我們將在體外構建包含這些酶因子 （如RimM, RbfA, Era, Obg, Der以 及YlqF等）的核

15、糖體復合體，解析它們的三維結構，從而了解這些酶和核糖體 亞基之間的相互作用，并根據獲得的三維信息，進一步設計生物實驗，以深入開 展相關的功能性研究。b.膜蛋白復合體的結構和功能的研究人類的很多重大疾病包括神經系統疾病、心血管疾病、呼吸系統疾病等都和 膜蛋白密切相關。對膜蛋白的結構和功能的深入研究是我們進一步了解這些疾病 的分子成因以及設計針對性藥物的基礎。迄今為止，只有大約 300多個膜蛋白的 結構被解析，還遠不到已知蛋白質數據庫中收錄中所有結構的1%。膜蛋白及其復合體三維結構的解析，以及其結構與功能關系的研究是目前蛋白質科學研究的 難題和熱點。X-射線晶體學仍然是獲得高分辨率的膜蛋白三維結構

16、的主要手 段。然而，多數膜蛋白是以復合體的形式發(fā)揮功能，由嵌入膜內的疏水部分（或者亞基）和伸在膜外的親水部分（或亞基）組成兼性蛋白復合體，如數 量眾多的跨膜轉運蛋白復合體、膜蛋白受體、核膜上的核孔復合體等。這些膜蛋 白復合體一般是由幾個或者幾十個蛋白組成， 而且在執(zhí)行功能的時候寡聚結構狀 態(tài)可能發(fā)生改變。盡管膜蛋白復合體的局部結構可以通過X-射線晶體學的方法得到，但是其整體組裝和動態(tài)的結構變化， 卻需要借助獨具手段的單顆粒冷凍電 子顯微學來進行研究。國際上綜合運用X-射線晶體學與單顆粒冷凍電鏡技術研究膜蛋白復合體的工作也剛剛開始開展，例如對細胞因子IL-6與膜上受體復合物的研究。我們擬從以下三

17、個方面開展工作：（1）針對樣品制備、電鏡圖像處理以及圖 像篩選等方面，開展膜蛋白復合體的單顆粒三維重構的方法學研究。 （2）細胞膜 上受體與配基復合物的結構和功能的研究。 我們將結合單顆粒冷凍電子顯微學及X-射線晶體學技術，以白細胞介素-1 （Interleukin-1, IL-1 ）家族細胞因子與受體 復合物為目標，開展結構解析以及結構與功能關系的研究工作。目前為止，已發(fā)現的白細胞介素-1家族分子有11個，其中研究最為深入的包括IL-1 , IL-1 , IL-1 receptor antagonist （IL-1ra）, IL-18和IL-33,這些細胞因子具有廣泛的生物 活性，在機體免疫

18、應答、炎癥、自身免疫和組織損傷過程中起著重要作用。它們 還與許多疾病的病理過程相關，如敗血性休克、風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸部疾病、 發(fā)熱等）。IL-1家族細胞因子的作用是通過細胞膜上的受體分子介導，進而誘發(fā) 胞內的多條信號傳導通路。目前已知的 IL-1受體分子包括IL-1RI , IL-1RII , IL-1RAcP, IL-18R , IL-18R , T1/ST2等。IL-1家族細胞因子與受體組成三元 復合物，例如IL-1與IL-1的作用通過受體IL-1RI與IL-1RAcP介導，IL-18的 受體分子包括IL-1 R 與IL-18R , IL-33的受體分子包括T1/ST2和IL-1RAc

19、P。 對這些IL-1家族細胞因子與受體三元復合物的單顆粒冷凍電鏡及X-射線晶體結構研究不僅能給我們提供一個IL-1信號從胞外傳導至胞內的完整畫面，也為以IL-1信號通路為靶標的藥物設計在配基受體結合點上提供了結構基礎。（3）開展對ESCRT-III蛋白復合體、hCRP-C1q蛋白復合體及鎂離子轉運通道蛋白寡聚體 等膜蛋白復合體的整體結構的單顆粒解析以及結構與功能關系的研究。其中，ESCRT-III蛋白復合體（約450kDa）在逆轉錄病毒顆粒的出芽中起關鍵作用，與阿爾茨海默（AD）病及HIV病毒感染有關。hCRP-C1q蛋白復合體由C-反應蛋 白和膜上補體蛋白組成，是一種典型的急性期蛋白復合體，

20、參與人的炎癥反應， 在免疫系統反應及抑制動脈粥狀硬化（AS）發(fā)揮重要功能。而鎂離子轉運通道 蛋白寡聚體CorA是參與鎂離子跨膜轉運的主要系統之一，維持細胞正常的生命 活動所必需的。課題三，高對稱性生物大分子復合體的高分辨結構及其動態(tài)過程的研究生物大分子復合體的對稱性在自然界中普遍存在，例如十四次對稱的GroEL、七十六次對稱的真核細胞核蛋白Vault、十二面體對稱的丙酮酸鹽脫氫酶復合體，八面體對稱的大腸桿菌蛋白 DegP以及和二十面體對稱的很多病毒殼 等。單一生物大分子復合體中也可能存在多種不同對稱性，如噬菌體的頭部呈二 十面體對稱性，通過十二或十三次對稱的連接蛋白聯接六次對稱的尾部。生物大分

21、子復合體的高對稱性組裝一方面反映了基因信息的高效經濟利用，另一方面也顯示了復合體功能過程中的協同作用機制。 在客觀上，這些高對稱性的存在使得 高分辨率結構的獲得變得相對容易。 例如，具有n次對稱的大分子復合體在某個 取向（如果不在m對稱軸線上）的透射電子投影圖像所能獲取的信息也同時包 含了其它n-1個對稱相關方向取向的電子圖像信息；而通過 m對稱軸線的成像， 也同時包含有（n/m-1）個其它m對稱軸線方向的信息。在多面體大分子復合體 的取向和中心位置確定上，目前一個常用方法是通過搜索等價線（ common-line） 的位置來實現。高對稱性的存在相應增加了與對稱性相關的等價線條數，從而大大提高

22、了等價線定位的精度。因此，相對于低對稱或非對稱的樣品，高對稱性樣 品的電鏡圖像的取向和中心位置的確定過程中誤差大大減少，就有更好機會獲得更高分辨率三維結構。本課題的實施旨在以高對稱性的生物大分子復合體為研究對象，繼續(xù)提高冷凍電鏡高分辨結構解析的能力，并開展結構和功能相互關系的研究。a.獲得一系列高對稱性生物大分子復合體的高分辨冷凍電鏡結構，并爭取獨立 構建近原子級分辨率模型（1）以腸道病毒71型、重組人杯狀病毒殼和重組 EB病毒殼等為研究對象， 開展對這些具有二十面體對稱性的病毒殼的高分辨冷凍電鏡結構的解析。這些都是重要的人類病毒，其中腸道病毒 71型在嬰幼兒中引發(fā)手足口病、神經系統疾 病甚至

23、死亡，人杯狀病毒引起急性傳染性腹瀉，而EB病毒與中國南方高發(fā)的鼻煙癌緊密相關。（2）以狂犬病毒的核殼蛋白十聚體等為研究對象，開展非二十面 體的高對稱性復合體的冷凍電鏡三維結構解析。（3）以皰疹病毒等為研究對象，對高對稱性復合體的局部非高對稱性結構（如皰疹病毒的Portal）展開冷凍電鏡三維重構研究。當重構分辨率不足以建立原子模型的時候， 參照同源蛋白和所獲 得的三維結構密度圖進行準原子模型的構建。（4）針對以上具有不同對稱性的結構解析，探索開發(fā)高對稱性復合體三維重構的新方法。如針對較大尺度的高對 稱性大分子復合體的高分辨率結構研究； 還希望利用不同的對稱匹配函數（如二 十面體、八面體、四面體及

24、二面體對稱匹配函數），對電鏡數據進行擬合，并充 分利用生物大分子復合體的對稱性，達到有效抑制噪聲，最終提高分辨率的作用。b.構建具高對稱性的生物大分子復合體在不同生理狀態(tài)或功能狀態(tài)下的高分辨時空模型利用冷凍電鏡制樣能夠保持生物大分子生理狀態(tài)下結構的特點，通過生物化學手段，對不同生理狀態(tài)下的同一生物大分子進行分離，解析其在不同生理過程中的高分辨三維結構；觀察蛋白結構域的變化，在分子或者氨基酸殘基的水平上 研究蛋白結構功能間的相互聯系；并針對某些氨基酸殘基加以突變，觀察其三維 結構變化，研究其在大分子功能中所起的作用。本研究將以腸道病毒71型等為研究對象，獲得在不同生理狀態(tài)和功能狀態(tài)的三維重構，并

25、構建它們的高時空分辨率模型。腸道病毒71型是在酸性的腸道中開始其細胞感染過程的，但病毒致 病和病理發(fā)生很多是在偏中性的神經細胞中進行的。因此需要了解不同生理環(huán)境下該病毒的結構變化以及病毒感染和病理發(fā)生的結構學基礎。另外，目前對該病毒的中和性抗原位點在病毒殼上的定位以及抗體中和的機制尚不清楚。通過獲取病毒在不同生理狀態(tài)下以及和中和性單抗 Fab的復合體的高時空分辨率結構，就 可以準確定位中和性抗原位點，揭示抗體中和的分子機制。這方面的研究將為制 備廣譜的中和性抗體和優(yōu)化疫苗的設計提供堅實的實驗依據和理論基礎。課題四，病毒、亞細胞器和細胞的高時空分辨結構及其功能的在體 /原位研究冷凍電子斷層成像方

26、法是目前唯一一個能在納米水平觀察細胞內蛋白質的 結構和相互作用的方法，填補了低分辨率的光學顯微分析以及原子分辨率的X射線晶體學之間的空白。同時，它在保持生物體活性和結構特征細節(jié)等方面具有 獨特的優(yōu)勢。本課題的主要研究內容是a.冷凍電子斷層成像的高通量數據收集以及電子斷層圖像的自動處理和高精度三維重構的方法研究對于具有結構同一性的蛋白、病毒及其復合物等的三維重構，可采用課題一 至三中的單顆粒重構方法進行結構解析。但對沒有結構同一性的病毒及其復合 物，以及細胞器和細胞水平下的蛋白質相互作用的三維結構解析，只能采用電子斷層成像方法通過獲取同一區(qū)域的多個角度的投影圖來反向重構它們的三維結 構。電子斷層

27、成像數據采集時傾轉樣品臺，存在兩個問題需要解決：第一，由于儀器樣品臺只能傾轉到有限的角度 與0 ,導致士(70 -90 )的數據缺失，此即所 謂數據失錐問題“(missing cone problem)；第二，由于樣品臺傾轉，導致樣品 不同區(qū)域相對于焦點具有不同的高度，因此受不同的襯度傳遞函數( contrast transfer function)調制。目前常用的結構解析方法還沒有很好地處理這兩個問題， 限制了結構解析的分辨率。我們將在課題進行過程中對這兩個問題進行深入的研 究，采用雙軸傾轉等方法盡量克服“數據失錐問題”的影響，并對不同高度的區(qū) 域進行襯度函數校正。同時，我們將充分結合電子斷

28、層成像和單顆粒分析的各種優(yōu)勢，在用電子斷 層成像方法得到病毒、細胞器以及細胞切片等的三維結構后，對其中具有重要生 物學意義的重復亞單元利用單顆粒分析類似的方法進行三維空間中的多顆粒平 均以及分類，以得到這些亞單元的高精度三維結構。本部分可以和課題一的團隊進行密切配合與交流。此外，隨著電子顯微鏡硬件設備的改進和電子斷層成像應用的越來越廣泛， 冷凍電子斷層成像的全自動、高通量數據收集以及圖像的自動處理和高效三維重 構也有更為迫切的需求。因此，我們在課題進行過程中將努力探討新的樣品制備、 數據采集、圖像處理和三維重構方法，與課題一密切配合并積極采用課題一的最 新研究成果。同時，我們將發(fā)展 X-ray

29、/NMR數據與電子斷層數據整合算法，擴 展數據范圍，并提高結構解析的分辨率。在以上電子斷層的方法學的研究之上，我們將開展以下方面的應用工作： b.心肌細胞內部及其鈣火花”分子機器、肌細胞興奮-收縮耦聯分子機器的在體 /原位三維重構心肌細胞上的鈣信號轉導是調控心肌細胞興奮-收縮耦聯的關鍵因素。其基本 單元一鈣火花”的發(fā)放過程涉及到多種分子的相互作用，比如細胞表面質膜上有電壓門控L-型鈣離子通道，肌漿網膜上有負責鈣釋放的離子通道一ryanodine受體(RyR)。RyR分子排列成二維分子陣列，形成鈣釋放單元(Ca2+ releaseunit/CRU);質膜L-型鈣通道與鈣釋放單元耦聯，形成二聯體。

30、在心臟收縮期， 由L-型鈣通道的鈣內流觸發(fā)鈣釋放，成十倍地放大鈣信號，這一過程稱之為鈣致鈣釋放”。對于這樣一個復雜的過程中涉及到的多種分子的三維結構，特別是在心肌細胞中的這些分子與分子之間如何進行相互作用，目前所知甚少。本課題的研究將揭示這些分子機器對鈣信號轉導的作用機理及調控機制及其與生理活 動和心力衰竭的關系，為心臟病的預防及治療提供指導。c.利用冷凍電子斷層成像方法研究 AIDS病毒、SARSW毒和禽流感病毒等包膜 病毒的結構包膜病毒對人體靶細胞的侵蝕都是通過病毒表面的包膜蛋白（ENV）和位于靶細胞表面的受體結合而引發(fā)的。在針對這些病毒的疫苗開發(fā)中，如何誘發(fā)和 ENV蛋白有效結合的中和抗

31、體（Neutralizing antibody, Nab）是需要解決的關鍵 問題。這些包膜蛋白在真實病毒表面的分布和結構信息，它們和receptor/Nab在細胞生理環(huán)境下如何相互作用，作用位點和方向如何，都所知甚少。本課題將利 用冷凍電子斷層三維重構方法研究 AIDS病毒、SARS病毒以及流感病毒等和靶 細胞受體以及不同結合位點的中和抗體的在體 /原位相互作用。通過解析這些重 要疾病相關的病毒ENV-Receptor/Nab復合體的高分辨三維結構來精確定位靶細 胞受體以及不同的中和抗體在真實病毒表面的空間位置、作用位點及方向，分析病毒表面抗原的結構組成細節(jié)。d.利用冷凍電子斷層成像方法研究其

32、它具有重要生物學意義的大分子及其復合物的三維結構除了以上心肌細胞“鈣火花”分子機器以及包膜病毒表面結構等，我們還將利用冷凍電子斷層成像方法研究其它具有重要生物學意義的生物大分子以及 復合物的結構，如對表觀遺傳起重要作用的核小體-蛋白酶復合物的結構，染色質的高級結構及其調控的結構機制等。e.開展心肌細胞鈣釋放以及病毒-靶細胞動態(tài)相互作用等重要生物過程的具有 時間分辨率的電子斷層研究結合定點突變等生化手段和快速冷凍的方法， 我們可以將心肌細胞鈣釋放以 及病毒-細胞相互作用等重要生物過程的不同時間階段（如心肌細胞鈣釋放的不 同時間段、病毒-靶細胞的融合、病毒在細胞內的組裝、成熟以及出芽階段等） 分別

33、制樣并進行冷凍電鏡斷層成像。 基于課題一中的方法學工作，特別是最大似 然法等非監(jiān)督性分類方法，對獲取的不同時間段的樣品數據以及同一時間段內可 能包含的不同構象的樣品數據進行三維重構和分類，由此獲得心肌細胞的鈣釋放 過程和病毒與靶細胞的結合過程在不同時間段的動態(tài)形態(tài)。 通過對這些動態(tài)變化 過程的可視化研究，開展對鈣釋放過程以及病毒 -靶細胞的融合與復制過程的動 力學及其調控因素的研究。二、預期目標總體目標冷凍電鏡結構生物學是當今國際生命科學領域的重點和熱點之一。本項目將致力于探索相關生命過程中的重大科學問題，培養(yǎng)一批冷凍電鏡結構生物學人 才，推動中國冷凍電鏡結構生物學研究進入世界領先水平。我們的

34、總體目標是集中力量開發(fā)全自動化、高通量的冷凍電子顯微學方法，并在此基礎上開展對重要 生物大分子復合體（如核糖體、膜蛋白、病毒等）的高時空分辨的功能態(tài)結構的 解析，同時開展基于電子斷層成像方法的在細胞和亞細胞水平上的實時在體研 究。五年預期目標.建立一流的冷凍電子顯微學技術平臺，開發(fā)全自動化、高通量冷凍電鏡數據 采集系統、高性能并行化的圖像處理和三維重構方法，以及解決結構不均一 性的電鏡數據分類方法。.利用單顆粒重構方法，解析若干個與重要生命活動及重大疾病相關的生物大 分子復合體的高分辨的功能態(tài)結構，包括原核和真核細胞各功能態(tài)下的核糖 體，IL-1家族細胞因子與受體三元復合物，跨膜轉運復合體等膜

35、蛋白相關復 合物，具有二十面體對稱性的病毒殼（如腸道病毒 71型，重組人杯狀病毒殼 等），非二十面體對稱性的病毒蛋白復合體（如水庖性口炎病毒的核殼蛋白 多聚體等），以及具有局部低對稱性病毒等。.利用電子斷層成像方法利用電子斷層成像方法，進行正常的細胞生理環(huán)境下蛋白-蛋白、病毒-分子、以及病毒-細胞等相互作用的可視化研究，構建一些 與重要生命現象或重大疾病相關的生命過程的高精度三維結構模型。解析心肌細胞“鈣火花”分子機器、包膜病毒表面分子及其復合物、以及核小體-修飾酶等其它具有重要生物學意義的大分子及其復合物的三維結構。.在冷凍電鏡結構生物學領域培養(yǎng)一支高水平科研隊伍。培養(yǎng)一批優(yōu)秀的碩士研究生，

36、博士研究生和博士后研究人員。.研究成果主要以研究論文形式公布，擬在一流國際刊物上發(fā)表學 術論文30篇以上。三、研究方案1、總體思路本課題的中心學術思想是依據國家 2006-2020年中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃 綱要中的 蛋白質研究”重大計劃，集中力量發(fā)展冷凍電子顯微學這一具有高度潛 力的結構生物學新技術和新方法。對一系列重要的生物大分子復合體的結構和功 能展開研究，力爭獲取它們在各功能狀態(tài)下的冷凍電鏡高時空分辨結構，進而闡明這些重要生物大分子復合體的結構與功能的關系。本項目課題1致力于突破高分辨冷凍電鏡結構解析的限制因素，積極展開方法學領域的研究，開發(fā)全自動化、 高通量冷凍電鏡數據采集和三維重構

37、圖像處理方法。在課題1的基礎上，課題2將利用單顆粒三維重構方法解析若干個與重要生命過程相關的低對稱或非對稱 性的生物大分子復合體（包括細胞內可溶的大分子復合體， 以及一些重要膜蛋白 或者與膜相關聯的蛋白）的高分辨結構，尤其是與它們的動態(tài)過程直接聯系的各 種功能態(tài)的結構，并同時開展相關的生理功能性的研究； 課題3致力于解析一系 列重要的高對稱性病毒大分子的準原子分辨率結構（3-4?）,并獨立構建分子模 型，進而揭示這些病毒大分子的動態(tài)結構變化和功能的關系。課題4將利用冷凍 電子斷層成像方法，重構一系列病毒、亞細胞器和細胞的三維結構，開展重要的 在體/原位研究工作。課題1重點是理論方法上的研究和突

38、破，它的研究成果將 為課題2-4提供方法基礎；課題2-3是在分子層次上研究；課題 4是細胞和亞細 胞層次上的研究。這四個課題既相互關聯，又相互獨立。參與本項目的清華大學、中科院上海巴斯德研究所、中科院生物物理所、以 及北京大學是我國冷凍電鏡結構生物學的研究中心。我們將發(fā)揮各自優(yōu)勢，重點突破，共同協作，促進我國冷凍電鏡結構生物學的進步， 盡快使我國的結構生物 學研究達到世界領先水平，并培養(yǎng)出一批冷凍電鏡結構生物學的杰出人才。2、技術途徑1）本項目采取多學科相互交叉、滲透和有機結合的途徑，以冷凍電子顯微學為 主，結合應用數學、物理學、化學、信息科學、計算機科學等，開發(fā)全自動、 高通量冷凍電子顯微學

39、方法；2）本項目采用理論研究與實驗科學相結合的策略，理論研究（課題1）的成果指導實驗科學（課題2-4）,實驗科學中遇到的問題反過來推動理論研究，兩 者互相促進；3）本項目采用一般性與特殊性相結合的策略，既保證課題的相對獨立，又保證 課題的相互協調。對于所有課題都存在的一般性問題，如樣品的冷凍制備和 數據采集問題，所有課題同時進行，一旦有一個課題組成功，其它課題組可 借鑒成功的經驗，加快課題的進度；而對課題專一的特殊性問題，如圖像處 理問題和結構解析問題，則分別進行，各個擊破；4）本項目課題由分子層次到細胞與組織層次，由簡單到復雜，循序漸進，確保 項目成功；5）離體（in vitro）和在體（in vivo）研究相結合。一方面在