醫(yī)學免疫學課件：第22章 免疫學檢測技術(shù)

1、第二十二章 免疫學檢測技術(shù) （Immunological detecting technology）一、原理 抗原、抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)與定量指示和/或信號放大系統(tǒng)的有機結(jié)合，實現(xiàn)反應(yīng)的可視性（定性）和可比對性（定量）。二、經(jīng)典的免疫學檢測方法 1. 免疫沉淀 2. 免疫擴散 3. 免疫凝集 4. 免疫標記 1. 沉淀反應(yīng) (precipitation reaction) 要形成免疫復(fù)合物的沉淀，抗原抗體必須交聯(lián)起來?？乖贵w的比例不能過高或過低?？乖瓫Q定簇數(shù)目2。 1.2 免疫比濁反應(yīng) (immunonephelometry) 為最早應(yīng)用與臨床檢測的抗原抗體沉淀反應(yīng)，也是目前臨床廣泛應(yīng)用的

2、自動檢測方法。 2 免疫擴散反應(yīng)(immunodiffusion) 依據(jù)物質(zhì)在均質(zhì)載體中從高濃度向低濃度擴散，并在擴散過程中逐漸形成濃度梯度這一性質(zhì)。設(shè)計以凝膠為固相載體的抗原、抗體反應(yīng)系統(tǒng)。2.1 單向免疫擴散（single radial immunodiffusion） 在含有抗體的瓊脂糖凝膠上打孔，加入待測抗原，根據(jù)沉淀環(huán)的大小確定待測抗原含量 。2.2 雙向免疫擴散 (double immunodiffusion ) 應(yīng)用：（1）檢測抗原或抗體量；（2）兩種抗原是否有交叉反應(yīng) 2.3 火箭電泳(Rocket electrophoresis) （pH值取抗體中性，抗原帶負電荷） 2.4

3、免疫電泳(immunoelectrophoresis) 3. 凝集反應(yīng)(agglutination) 抗原附著在大的載體顆粒表面時，加入特異性抗體會使載體顆粒發(fā)生肉眼可以觀察到的凝集現(xiàn)象。 Coombs test hemagglutination 4. 利用標記物發(fā)展的抗原抗體探測 在肉眼不可見的抗原抗體反應(yīng)體系中引進指示和/或放大系統(tǒng)，使信號變得可見，較弱的信號被增強。目前采用的方法是將特異性抗體與標記物結(jié)合，制備抗體標記物結(jié)合物。 常用的標記物主要包括熒光素、同位素、酶和化學發(fā)光物質(zhì)。 4.1免疫熒光分析 細胞熒光染色（直接法，間接法）可以對細胞膜、細胞內(nèi)和組織表達的特異性抗原進行檢測。4

4、.2 放射免疫分析 (radioimmunoassay，RIA) 常用的同位素標記物為 125I ，131I，3H 。4.3 酶聯(lián)免疫技術(shù)( enzyme linked immunosorbence assay，ELISA ) Direct ELISA ： 抗原包被到96孔板上 BSA封閉 加酶標 抗體 加入底物顯色Indirect ELISA：抗原包被到96孔板上 BSA封閉 加未酶標第一抗體 加酶標第二抗體 加入底物顯色Sandwich ELISA抗體包被到96孔板上 BSA封閉 加待測抗原樣品 酶標抗體 加入底物顯色建立sandwich ELISA方法的基本條件： 1. 被檢測抗原具有多

5、價（決定簇） 2. 二個抗體分別針對不同決定簇。Elispot 酶免疫斑點試驗T cellCD3IFN 蛋白印跡法（Western blotting）結(jié)合了SDS電泳和ELISA二種方法的共同優(yōu)點。 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 免疫磁珠 流式細胞技術(shù)(flow cytometry )免疫組織化學技術(shù) 三、免疫活性細胞功能、數(shù)量測定 1. 淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 原理：淋巴細胞在有絲分裂原的作用下，能夠發(fā)生增殖、分化，通過指示系統(tǒng)觀察細胞增殖過程中細胞合成代謝物質(zhì)量的變化，即可得知該細胞功能的變化。 有絲分裂原的作用有細胞類型的差異，也有動物種系差異。常見有絲分裂原對人和小鼠T、B細胞作用 小鼠 人 T B T B刀豆素A(ConA) 植物血凝素（PHA) 美洲商陸（PWM) 脂多糖（LPS) 葡萄球菌A蛋白（SAC) 純蛋白衍化物（PPD) 葡聚糖 抗Ig抗體 2. 細胞表面分子標記 原理：不同類型的免疫活性細胞在免疫應(yīng)答的不同階段表達不同的細胞表面分子，通過檢測特定標記分子數(shù)量的變化，即可得知該細胞數(shù)量或功能變化。 流式細胞檢測技術(shù)、免疫熒光檢測技術(shù)、免疫組織化學檢測技術(shù)、免疫化學發(fā)光技術(shù)常被用于上述目的。 3. 細胞因子檢測 （1）細胞生物學活性測定方法 原理：不同類型的免疫活性細胞在免疫應(yīng)答的不同階段，接受不同細胞因子的調(diào)控，通過檢測特定時段、特定