專題五課題1-DNA的粗提取與鑒定課件

1、專題5 DNA和蛋白質技術課題1 DNA的粗提取與鑒定 一、基礎知識（一）提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子3、提取DNA的基本思路利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分4、DNA的溶解性DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質沉淀，或者相反5、討論：根據DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下， DNA的溶解度最?。?DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？在NaCl溶液濃度

2、低于0.14 mol/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14 mol/L時，DNA溶解度最?。划擭aCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。當氯化鈉的物質的量濃度為 2 molL時，DNA的溶解度最大，濃度為 014 molL時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？8、DNA的鑒定 DNA與二苯胺（沸水?。境伤{色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑 甲基綠 （藍綠色）動物細胞的破碎較易，例如，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即

3、可（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液1、動物細胞答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？植物細胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細胞膜2、植物細胞討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解實例：提取洋蔥DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液答：研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全

4、，提取的DNA量變少，影響實驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等討論：如果研磨不充分，會對實驗結果產生怎樣的影響？（三）去除濾液中的雜質為了純化提取的DNA需要將濾液作進一步處理討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質和DNA。討論：方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分離 方案二利用了酶的專一性；方案三利用了DNA的穩(wěn)定性。2、 DNA的鑒定鑒定DNA時在試管中先加入物質的量的濃度為2mol/L

5、 的NaCl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4ml 試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍色（一）案例一：以雞血為實驗材料進行DNA的粗提取三、實驗案例雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設備要求較高，操作繁瑣，歷時較長1、雞血細胞做實驗材料的原因雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得2、實驗原理 DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當NaCl的物質的量濃度為0.14 molL時,DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以

6、使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進一步提取出含雜質較少的DNA。 DNA遇二苯胺（沸水?。境伤{色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。3、實驗材料和用具：雞血細胞液（510ml）；體積分數(shù)為95%的冷酒精溶液（實驗前置于冰箱內冷卻24h）；蒸餾水；質量濃度為0g/ml的檸檬酸納溶液；務質量的濃度分別為2mol/L和0015mol/L的氯化納溶液；二苯胺試劑。鐵架臺；鐵環(huán)；鑷子；三角架；酒精燈；石棉網；載玻片；玻璃棒；濾紙；滴管；量筒（100ml，一個）；燒杯；（100ml，一個，50ml、500ml各二

7、個）；試管（20ml，二個）；漏斗；試管夾；紗布。 4、課前準備雞血細胞液過程4、課前準備雞血細胞液取質量濃度為01g/ml的檸檬酸鈉溶液（抗凝劑）100ml，置于500ml燒杯中。注入新鮮的雞血（約180ml），同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免凝血。將燒杯中的血液置于冰箱內，靜置一天，使血細胞自行沉淀。（也可以將血液倒入離心管內，用1000r/min（轉每分）的離心機離心2min，血細胞沉淀于離心管底部。實驗時，用吸管除去離心管上部的澄清液，就可以得到雞血細胞液。）過程檸檬酸鈉作用防止血液凝固作用機理檸檬酸鈉能與血漿中的Ca2+發(fā)生反應，生成檸檬酸鈣絡合物，血漿中游離的C

8、a2+大大減少，血液就不會凝固雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液注意事項5、方法步驟 提取雞血細胞的細胞核物質將制備好的雞血細胞液5 mL10mL，注入到50 mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20 mL，同時用玻璃棒充分攪拌5 min，使血細胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細胞液過濾至500mL。取其濾液。提取雞血細胞的細胞核物質5、方法步驟 討論：答：讓細胞內濃度大于周圍溶液的濃度，細胞會吸水以至脹破（1）為什么要加入蒸餾水？加入蒸餾水后細胞會有什么變化？（2）用玻璃棒攪拌有什么意義？答：用玻璃

9、棒攪拌可以加速血細胞和細胞核的破裂。注意應沿一個方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）濾去的是什么物質？得到的是什么？答：過濾將濾去的是細胞膜和核膜等物質；得到的是與蛋白質等物質結合在一起的DNA溶解DNA析出含DNA的粘稠物濾取含DNA的粘稠物溶解DNA將氯化鈉的物質的量濃度為 2 mol/L的溶40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個方向攪拌1min，使其混合均勻，這時DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)沿燒杯內壁緩緩加入蒸餾水，同時用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會越來越多。當粘稠物不再增加時停止加入蒸餾水（這時

10、溶液中氯化鈉的物質的量濃度相當于0.14 molL）析出含DNA的粘稠物討論：加入蒸餾水的目的？降低NaCl溶液濃度到使DNA溶解度最低點，使DNA從NaCl溶液中析出將溶液中的DNA與其他雜質分離，這一步驟是實驗成敗的關鍵。實驗中應該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞注意事項：濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至 500mL的燒杯中，含 DNA的粘稠物被留在紗布上將DNA的粘稠物再溶解過濾含有DNA的氯化鈉溶液提取含雜質較少的DNA將DNA的粘稠物再溶解取 1個 50 mL燒杯，向燒杯內注入氯化鈉的物質的量濃度為 2

11、molL的溶液 20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃棒不停地攪拌，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中過濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個100 mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中提取含雜質較少的DNA在上述濾過的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分數(shù)為 95的溶液 50mL（使用冷卻的酒精，對DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會出現(xiàn)含雜質較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA答：因為DNA不溶于冷酒精，而其他物質可以溶解在酒精中，使含雜質較少的DNA絲狀物可以析出,懸浮于溶液中

12、討論：（2）觀察絲狀物呈什么顏色？答：白色（1）為什么要加50mL的冷酒精？取兩支20 mL的試管，各加入氯化鈉的物質的量濃度為0015 molL（或者2mol/L）的溶液5 mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱 5 min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化 DNA的鑒定討論：答：有絲狀物的試管變成藍色，另一試管還是原來顏色（2）這一鑒定結果說明什么問題？（1）比較兩個試管中溶液的顏色有什么不同？答：提取出的絲狀物是DNA（3） DNA的直徑約為2010-10 m，實驗中出

13、現(xiàn)的絲狀物的粗細是否表示1個DNA分子直徑的大??？答： DNA分子直徑只有2 nm。絲狀物是多個DNA子聚在一起形成的 提取雞血細胞的細胞核物質(過濾)溶解DNA析出含DNA的粘稠物濾取含DNA的粘稠物將DNA的粘稠物再溶解過濾含有DNA的氯化鈉溶液提取含雜質較少的DNA DNA的鑒定答：整個實驗共“兩次蒸餾水，三次過濾，兩次析出，六次攪拌”6、討論：兩次蒸餾水第一次：細胞吸水脹破 第一步第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步（1）此實驗過程中有幾次使用蒸餾水？幾次過濾，幾次析出，幾次攪拌？分別在哪一步？過濾時使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關，第二次要用其濾出的黏稠物有關，所以要使用多層紗布

14、，第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為2層三次過濾第一次： DNA存在于濾液里 第一步第二次： DNA被留在紗布上 第四步第三次： DNA存在于濾液里 第六步兩次析出第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含雜質多第三步第二次：用冷卻的95的酒精第七步六次攪拌：第一、二、三、五、七、八步其中除第八步外，其余均要朝一個方向攪拌，在第三、五步攪動還要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，這樣才能保證得到完整的DNA（準備階段還有1次）（2）為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。

15、因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質（二）案例二：以菜花為實驗材料進行DNA的粗提取1、課前準備將新鮮菜花和體積分數(shù)為95的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24 h2、提取DNA的具體步驟取材：稱取30 g菜花，去梗取花，切碎研磨：將碎菜花放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min研磨液的配制方法如下：將10.1 g Tris加入到50 mL蒸餾水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液調節(jié)pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定容至1 000 mLTris/HCl:

16、提供緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)（Tris為三羥甲基氨基甲烷）EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：是DNA酶的抑制劑，可以防止細胞破碎后DNA酶降解DNASDS（十二烷基磺酸鈉）：可以使蛋白質變性，與DNA分離過濾：在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過濾到燒杯中(有條件的學?？蓪V液倒入塑料離心管中進行離心，用1000 r/min的轉速，離心25 min，取上清液放入燒杯中)。在4 冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液沉淀：將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數(shù)為95的預冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地攪拌溶液(玻璃棒不要直插到燒杯底部)。沉淀35 min后，可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻

17、璃棒緩緩旋轉，將絮狀物纏繞在玻璃棒上然后進行以雞血為實驗材料進行DNA的粗提取觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍色說明實驗基本成功，如果不呈現(xiàn)藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現(xiàn)錯誤，需要重新制備四、課題成果評價（一）是否提取出了DNA本實驗提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質（二）分析DNA中的雜質（三）不同實驗方法的比較對于不同的實驗方法，本課題可以采用分組的方法進行研究。首先選取不同的實驗材料，其次同種材料還可以采用不同方法，從多方面比較實驗結果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺顯色的深淺等，看看哪種實驗材

18、料、哪種提取方法的效果更好1、在制備雞血細胞液的過程中，加入檸檬酸鈉的目的是（ ）A .防止凝血 B. 加快DNA析出C .加快DNA溶解 D.加速凝血練一練A 2、DNA的溶解度最低時，NaCl的物質的量濃度為（ ）A 2mol/l B 0.1mol/l C 0.14mol/l D 0.015mol/l3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（ ）A 加快DNA溶解的速度B 加快溶解雜質的速度C 減小DNA的溶解度，加快DNA析出D減小雜質的溶解度，加快雜質的析出C C 4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不斷加入蒸餾水,在這個過程中DNA的溶解度變化情況分別是A 減小;減小 B 增大;增大C 先減小后增大 D增大;