非小細胞肺癌基因檢測PPT

1、關(guān)于非小細胞肺癌基因檢測第一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月前言隨著分子醫(yī)學(xué)進展和靶向藥物的不斷涌現(xiàn)，晚期非小細胞肺癌（NSCLC）的治療已進入到個體化治療的時代。目前臨床應(yīng)用的個體化靶向治療主要針對EGFR突變型和ALK融合基因型肺癌,這兩種基因變異型肺癌均具有明確的分子靶點、靶點檢測技術(shù)及上市的靶向藥物，臨床療效得到明顯提高。第二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月EGFR突變檢測中需要明確的幾個基本概念2、基因突變是指DNA發(fā)生堿基序列的改變：須選擇有針對性的檢測手段，針對非DNA的檢測手段如：RT-PCR（檢測RNA表達），免疫組化（檢測蛋白表達）以及針對非堿基序列的檢

2、測手段如：FISH（檢測DNA的擴增、缺失、斷裂、融合）等，均不適用。體細胞突變發(fā)生在非種系組織中不具有遺傳性不會遺傳給子代種系突變發(fā)生于精子或卵子中可以遺傳子代子代所有細胞均帶突變1、EGFR突變?yōu)轶w細胞突變：發(fā)生于腫瘤細胞中，正常細胞（癌旁或白細胞等）不含突變。要盡可能取到足量的腫瘤細胞進行檢測，這是保證檢測結(jié)果可靠的根本前提。第三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月EGFR基因突變檢測概念EGFR突變檢測指腫瘤組織中編碼EGFR基因的DNA突變狀態(tài)檢測并不是：EGFR基因DNA拷貝數(shù)的檢測（FISH法）EGFR蛋白表達量的檢測（IHC法）。EGFR檢測檢測物質(zhì)部位方法基因突變DNA

3、細胞核測序法、ARMS法等拷貝數(shù)DNA細胞核熒光原位雜交法（FISH）蛋白表達蛋白質(zhì)細胞膜免疫組化法（IHC）RNA表達RNA細胞核RT-PCRX第四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Nature Review 2007, 7:169NSCLC中EGFR酪氨酸激酶區(qū)突變種類第五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月標本采集及病理評估DNA 抽提及質(zhì)控檢測報告EGFR突變檢測ARMS測序法其它方法EGFR 突變檢測流程第七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月EGFR突變檢測中的相關(guān)角色患者臨床醫(yī)生胸外科醫(yī)師內(nèi)鏡醫(yī)師收集肺癌組織標本病

4、理科醫(yī)生準備樣本實驗操作及結(jié)果分析實驗室人員報告結(jié)果給臨床醫(yī)生腫瘤科醫(yī)生放療科醫(yī)生呼吸科醫(yī)生第八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月用于EGFR突變檢測的標本腫瘤組織目前最可靠的標本；其它樣本： 外周血（血漿、血清） 細胞學(xué) （胸水、痰液細胞學(xué)） 支氣管刮取物 仍需進一步研究確定這些樣本在臨床實踐及診斷中的應(yīng)用第九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月標本問題石蠟組織：盡可能送檢一年內(nèi)的石蠟標本。石蠟切片：含腫瘤細胞越多越好（50%以上）；組織部位面積約6mm x 6mm以上；包埋組織：組織塊不小于0.50.50.5（cm）。新鮮組織：比石蠟等處理過的舊組織，DNA保存得更完整，對P

5、CR實驗更有利，但一定要經(jīng)病理學(xué)確認。含有腫瘤組織50%以上；重量10g（約米粒大小以上），經(jīng)PBS或生理鹽水沖洗干凈。取癌組織的中心位置組織塊（避開壞死區(qū)域），固定于10%中性福爾馬林溶液中，盡快送病理科。細胞學(xué)標本：可用原發(fā)灶與復(fù)發(fā)灶：只要能獲得足夠的癌細胞，均可；但對于復(fù)發(fā)的患者，再次活檢不僅可確診，還可以獲得分子標志物的進一步信息。第十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月標本因素對EGFR突變檢測的影響-腫瘤組織特點-遺傳異質(zhì)性 對檢測方法敏感度有較高要求正常細胞混雜第十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月標本因素對EGFR突變檢測的影響-組織標本種類- 對檢測方法有相應(yīng)

6、要求，組織標本及DNA質(zhì)控尤其重要 冰凍新鮮組織 固定包埋組織-外科手術(shù)標本完整，量多廣泛-小活檢標本完整，量少受限-外科手術(shù)標本片段化，量多受限-小活檢標本片段化，量少極度受限D(zhuǎn)NA質(zhì)與量適用方法第十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月圖4. EGFR基因檢測使用的臨床樣本及其操作。A.被切成10微米的石蠟包埋標本。B.在支氣管鏡下將刷檢樣本放在生理鹽水中洗凈（懸浮），可以就這樣冷凍保存，C.進一步將該生理鹽水液離心，沉淀溶解于AL緩沖液，此狀態(tài)可以室溫保存。 第十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月腫瘤組織標本的采集及病理評估腫瘤組織標本病理學(xué)評估組織切片非小細胞性肺癌診斷

7、及類型腫瘤細胞比例腫瘤細胞總數(shù)標識腫瘤豐富的區(qū)域富集腫瘤細胞H&E 染色片用于病理評估白片用于提取DNA建議最少切片數(shù)：-手術(shù)標本，5 m X4-小活檢標本，5 m X8 組織標本來源手術(shù)標本支氣管下活檢經(jīng)皮穿刺活檢 標本處理及貯存新鮮凍存：液氮或-80CFFPE第十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月檢測方法目前 EGFR 基因突變的檢測方法很多DNA 直接測序法應(yīng)用廣泛，可檢測已知的突變和未知的突變，但對標本的腫瘤細胞含量要求較高，一般要求標本中腫瘤細胞的比例在 50% 以上，至少不低于 30%?；趯崟r熒光定量 PCR 基礎(chǔ)上的方法（如 ARMS 法）較直接測序法更加敏感，可檢測

8、樣品中 1.0%0.1% 的突變基因，更適合用于腫瘤細胞含量較少的小標本檢測。ARMS 方法操作簡單，是目前臨床上較常用的方法之一，但只能檢測已知的突變，且標本需進行預(yù)處理，檢測費用較高。第十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月直接測序法流程及數(shù)據(jù)分析PCR*純化測序反應(yīng)測序儀毛細管電泳純化數(shù)據(jù)分析EGFR deletionEGFR L858R電泳質(zhì)控組織標本DNA*PCR是關(guān)鍵：-特異性-產(chǎn)物長度-必要時巢式-建議通用測序引物第十六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月DNAARMS反應(yīng)實時定量 PCRARMS法操作流程及數(shù)據(jù)解讀數(shù)據(jù)分析內(nèi)參信號 (HEX)突變信號: + -內(nèi)參

9、信號: + +標本 1（突變陽性）標本 2（突變陰性）突變信號 (FAM)組織標本內(nèi)參信號 (HEX)第十七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月測序法與ARMS法比較測序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE標本成功率低高檢測流程復(fù)雜慢長簡單快速數(shù)據(jù)分析要求高低假陽性機會(交叉污染)多少假陰性機會多少儀器成本高低商用試劑盒無有試劑成本低略高第十八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月小結(jié)：了解你的標本-新鮮/冰凍組織FFPE組織-手術(shù)標本小活檢標本選擇合適的方法-ARMS是目前較敏感快速方法，且容易開展-測序是傳統(tǒng)的方法，但敏感度有限，過程復(fù)雜，不易普及做好組織標本及DNA質(zhì)控是關(guān)

10、鍵非腫瘤組織標本的有效利用-在無腫瘤組織情況下，外周血cfDNA、胸水及細針穿刺等細胞學(xué)標本均可用于檢測EGFR突變，但其確切的敏感度與特異性尚需進一步探索-必須選擇足夠敏感的方法第十九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月EGFR激酶抑制劑的耐藥性作為臨床上的最大問題，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均產(chǎn)生耐藥。其中50%患者是在缺失或L858R等的敏感性突變的基礎(chǔ)上，又發(fā)生了第790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變（T790M）。在EGFR-TKI治療前很少存在T790M（13%22），這種情況下TKI難以有效。另外50%患者中，其中大約一半患者的耐藥性是由MET基因擴增引起的，EGFR

11、-TKI抗藥性出現(xiàn)時再進行基因檢測，可以選擇與其耐藥機制相對應(yīng)的治療方法。即在一個患者的各種臨床情況中，掌握EGFR與相關(guān)基因的信息，以期進一步改善臨床療效。 第二十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月EGFR激酶抑制劑耐藥的處理原則對于緩慢進展的患者，建議繼續(xù)使用原來的 EGFR-TKI 治療或 EGFR-TKI 聯(lián)合化療；對于快速進展的患者，推薦停用 EGFR-TKI，改用化療；于局部進展且原有病灶控制良好的患者，建議繼續(xù)使用 EGFR-TKI 并聯(lián)合局部治療。第二十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月EGFR激酶抑制劑耐藥研究進展第一代EGFR抑制劑Gefitinib (易

12、瑞沙, Iressa)和Erlotinib (特羅凱, Tarceva) 隨著其在臨床上的廣泛應(yīng)用，耐藥問題日益突出。其中，EGFR-T790M突變約占臨床耐藥病人的60%以上。第二代EGFR抑制劑Afatinib(阿法替尼)。于2013年9月FDA批準上市，于2014年1月在3期臨床研究中以失敗告終。Afatinib在體外對EGFR-T790M突變有活性，但臨床仍然未能克服T790M突變產(chǎn)生的耐藥性。第三代EGFR抑制劑。國外多個制藥公司和研究機構(gòu)都在開展對T790M突變的小分子抑制劑研究，其中包括克洛維斯腫瘤公司的CO-1686和阿斯利康的AZD9291, 但還沒有針對該突變的藥物上市。第

13、二十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 ALK 融合基因是新發(fā)現(xiàn)的 NSCLC 驅(qū)動基因，其中棘皮動物微管相關(guān)類蛋白 4（EML4）基因與 ALK（間變性淋巴瘤激酶）的融合（EML4-ALK）為最常見類型。ALK 融合基因主要出現(xiàn)在不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者，且通常與 EGFR 基因突變不同時存在于同一患者。NSCLC 患者中 ALK 融合基因的發(fā)生率約為 5%，而在 EGFR、KRAS、HER2 或 TP53 等基因無突變的 NSCLC 患者中，ALK 融合基因陽性率達 25%；我國 EGFR 和 KRAS 均為野生型的腺癌患者中 ALK 融合基因的陽性率高達 30%42% 。病理

14、形態(tài)學(xué)研究提示在含印戒細胞的粘液型或?qū)嵭韵侔┲?，ALK的發(fā)生率高于其他類型的肺腺癌（46.2% vs 8%）ALK陽性的NSCLC雖然僅占全部NSCLC的5%，但是每年新發(fā)病例數(shù)在中國仍接近30,000例ALK融合基因概念第二十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月目前檢測 ALK 融合基因的常用方法主要有熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、基于 PCR 擴增基礎(chǔ)上的技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法（IHC）。FISH 目前仍是確定 ALK 融合基因的參照標準方法，但價格昂貴，操作規(guī)范要求較高，尚不適用于 ALK 陽性患者的篩查。實時熒光定量 PCR 操作簡便，敏感度高，但需要特定的試劑盒和儀器。IHC

15、 簡便易行、價格便宜、操作方法成熟。VentanaALK 融合蛋白 IHC 診斷試劑盒在不影響特異度的前提下，進一步提高了敏感度，與 FISH 結(jié)果的吻合率達到 98.8%，可重復(fù)性達 99.7%，已經(jīng)獲 CFDA 批準用于診斷 ALK 陽性的 NSCLC 患者。ALK融合基因檢測方法第二十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月ALK融合基因陽性有效靶向藥物針對ALK靶點的小分子抑制劑克唑替尼（Crizotinib）是一種ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑，可特異性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信號通路。臨床試驗顯示對于ALK陽性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療，二線單藥治療患者的中位PFS為7.7個月，有效率達到65.3%4?；谄淞己玫寞熜Ш湍褪苄?，2013年初，中國食品和藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）已批準克唑替尼用于治療ALK融合陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者常見不良反應(yīng)（發(fā)生率25%）包括視力障礙、惡心、腹瀉、水腫及便秘等第二十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于