中南民族大學藥學院化學生物學教研室課件

1、中南民族大學 藥學院化學生物學教研室尼龍固定化木瓜蛋白酶化學生物學實驗1.實驗目的化學生物學實驗6學時12學習尼龍固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。掌握共價結合法固定化酶的原理和方法。中南民族大學 藥學院化學生物學教研室2.實驗原理化學生物學實驗6學時1234酶不與產品混合，制品易于純化。在大多數情況下，可提高酶的穩(wěn)定性。提高酶的使用效率，降低生產成本。利用固定化酶，工業(yè)上可以大批量、連續(xù)化生產定義：通過物理或化學的方法，將水溶性的酶與水不溶性載 體結合，使酶固定在載體上，并在一定的空間范圍內 進行催化反應的酶稱為固定化酶。固定化酶的優(yōu)越性主要表現在：2.實驗原理化學生物學實驗6學時包埋法共價鍵結

2、合法交聯法酶的固定化方法有：吸附法(物理吸附、離子吸附)12343.實驗材料、試劑及儀器化學生物學實驗6學時材料(1)尼龍布(86或66)，140目，剪成3 cm3 cm大小的方塊(2)吸水紙儀器 (1)恒溫水浴鍋 (2)紫外分光光度計 (3)冰箱及玻璃器皿中南民族大學 藥學院化學生物學教研室3.實驗材料、試劑及儀器化學生物學實驗6學時 (1)18.6% CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65 mol/LHCl溶液 (4)0.2 mol/L硼酸緩沖液(pH值8.5) (5)5%戊二醛溶:用0.2 mol/L,pH值8.5的硼酸緩沖液配制 (6)0.1 mol/L硼酸緩沖液(pH值7.8

3、) (7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液 (8)0.1 mol/L磷酸緩沖液(含3% NaCl) (pH值7.2) (9)0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2) (10)激活劑：用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制，內含 20 mmol/L半胱氨酸、1 mmol/LEDTA的混合液。 (11)1%酪蛋白溶液：用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。主要試劑4.實驗步驟化學生物學實驗6學時2、酶活力測定(1)溶液酶活力測定：取0.2 mL酶液，加入2.3 mL激活劑，于 37 下預熱10min，加入37預熱的1%酪蛋白溶液mL

4、， 準確反應10 min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5 mL終止 酶反應。對照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶 液，其他與測定管相同，以8000 r/min的轉速離心10 min或 過濾，取其上清液于波長280 nm處測定吸光度。在上述條 件下，每10 min增加0.001個吸光度為1個酶單位(U)。(2)殘留酶活力測定：方法同溶液酶活力測定。(3)固定化酶活力測定：取一塊尼龍布固定化酶，加入2.5mL激 活劑，其余步驟與溶液酶測定相同。4.實驗步驟化學生物學實驗6學時表1 酶活力測定試劑溶液酶固定化酶殘留酶CK12CK12CK12激活劑（mL）1.81.81.82.02.02.01.81.81.8酶液/固定化酶（mL或塊）0.20.20.21塊1塊1塊0.20.20.237保溫5min37 1%酪蛋白（mL）11111137反應10 min20% TCA (ml)搖勻2222222221%酪蛋白（mL）111過濾5.實驗數據處理及計算化學生物學實驗6學時活力回收=固定化酶總活力數溶液酶總活力數100%相對活力=固定化酶總活力數(溶液酶總活力數-殘留酶活力數)100%6.注意事項尼龍布的處理是本實驗成敗的關鍵，既要讓其充分地活化，又不能使其破碎。固定化酶溶液濃度最好為0.51 m