毛細管電泳 精品課件

1、毛細管電泳 第1頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 毛細管電泳（capillary electrophoesis,CE) 也稱高效毛細管電泳（HPCE ），是以高壓直流電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品離子和分子的淌度或（和）分配行為上的差異而對其進行分離分析的新型電泳技術。 毛細管電泳實際上包含電泳、色譜及其交叉內容，它使分析化學得以從微升水平進入納升水平，并使單細胞分析，乃至單分子分析成為可能。 第2頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 特點1.儀器簡單、易自動化 電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高 在3.1min內分離

2、36種無機及有機陰離子，4.1min內分離了24種陽離子；分離柱效：105107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少 進樣量極少，水介質中進行；4.應用范圍極廣 有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學、醫(yī)學、藥學、化學、環(huán)境保護、材料等；第3頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 電場強度 也稱電位梯度，指單位長度（厘米）支持物體上/溶液介質中的電位降。 在CE中，電場強度等于某勻質電解質溶液所承受的電壓除以該溶液在毛細管中充盈的長度，它對帶電粒子的電泳起著十分重要的作用。 第4頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四電泳 帶電懸浮顆?；虼?/p>

3、電子在直流電場作用下，于一定介質（溶劑）中發(fā)生定向移位運動的物理化學現(xiàn)象，也稱為電遷移。 電泳的方向由粒子所帶電荷決定，帶正電的粒子向負極移動，而帶負電的粒子則向正極運動。 顆粒或大分子的遷移速度取決于電勢差、顆粒帶電量、顆粒大小、形狀、電解質溶液的PH、黏度等。 電場中帶電離子運動除了受到電場力的作用外，還會受到溶劑阻力的作用。一定時間后，兩種力的作用就會達到平衡，此時離子作勻速運動，電泳進入穩(wěn)態(tài)。第5頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四何為雙電層？ 雙電層是指兩相之間的分離表面由相對固定和游離的兩部分離子組成的。 雙電層是與表面異號的離子層，凡是浸沒在液體中的界面都會產

4、生雙電層。在毛細管電泳中，無論是帶電粒子的表面還是毛細管管壁的表面都有雙電層。 第6頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 雙電層 當毛細管內充滿緩沖溶液時，毛細管壁上的硅羥基發(fā)生解離，生成氫離子溶解在溶液中，這樣就使毛細管壁帶上負電荷與溶液形成雙電層 固體與液體接觸時，固體表面分子在液體中極性分子和離子的作用下可發(fā)生解離，并在固體界面上形成定域電荷。定域電荷吸附溶液中的離子，在固-液界面上形成雙電層。第7頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 電滲也稱電滲流，指毛細管柱內溶液在外加電場下整體朝一個方向運動的現(xiàn)象。交界面形成雙電層，在毛細管的兩端加上直流電場

5、后，帶正電的溶液就會整體的向負極端移動，這就形成了電滲流。電滲發(fā)生時，吸附層粒子固定不動，擴散層粒子帶動毛細管中的溶液單向運動。方向決定于擴散層荷電粒子種類，帶正電向陰極移動，帶正電向陽極移動速度與定域電荷、Zeta電位大小成正比，Zeta電位為0，速度也為0.第8頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四淌度電泳淌度，單位電場作用下在溶液中粒子的電泳速度 一定分析條件下，主要決定于荷電種類、粒子數(shù)量、形狀、大小、溶液PH等。 粒子帶凈電荷越多，直徑越小，形狀越接近球形，其電泳淌度越大。中性粒子電泳淌度為0.電滲淌度，單位電場作用下在溶液中粒子的電滲速度。是溶液的電滲作用以及粒子

6、與固定相（如凝膠、填充固定相等）或溶液中的某些組分（如膠束、環(huán)糊精等）相互作用的綜合結果。 與電場強度、毛細管材料、毛細管中溶液組成、濃度、PH、黏度、離子強度、添加劑等有關。表觀淌度，單位電場作用下在溶液中粒子的實際遷移速度。為電泳淌度與電滲淌度的矢量和。一定條件下，可獲得必點用速度高出一個數(shù)量級的電滲流。淌度為粒子的特征性參數(shù)，是CE分離的基礎。 第9頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 分離的原因分離的原因：電泳遷移，電滲遷移 電泳遷移：在高壓電場下，帶電離子向相反的方向移動。 電滲遷移：當毛細管內充滿緩沖溶液時，毛細管壁上的硅羥基發(fā)生解離，生成氫離子溶解在溶液中，這

7、樣就使毛細管壁帶上負電荷與溶液形成雙電層，在毛細管的兩端加上直流電場后，帶正電的溶液就會整體的向負極端移動，這就形成了電滲流。第10頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 分離 第11頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四HPCE中影響電滲流的因素1.電場強度的影響 電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細管材料的影響 不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產生的電滲流大小不同；第12頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四影響毛細管電泳分離效果的主要因素緩沖溶液的組成:如若形成絡合物，使電滲淌度發(fā)生改變

8、，提高分離效果。緩沖溶液的濃度:在恒定PH下，電滲淌度隨電解質濃度的增加而減小，改善分離效果。緩沖溶液的pH：1.對毛細管內壁定域電荷的多少有影響 2。對于有等電點的物質，影響有效電荷。 弱電解質則直接影響化學平衡而影響分離 緩沖溶液的添加劑：加入適當添加劑，控制電滲流的大小與方向，抑制管壁的吸附作用，增加疏水組分的溶解度，擴大分離對象，增加溶液粘度，降低電流，優(yōu)化分離條件。第13頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 常見毛細管電泳類型及原理 毛細管區(qū)帶電泳CZE 膠束電動毛細管色譜MEKC 毛細管凝膠電泳CGE 毛細管等電聚焦CIEF 毛細管電色譜CEC 第14頁，共27

9、頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 毛細管區(qū)帶電泳 毛細管區(qū)帶電泳中，帶電粒子的運動速度等于電泳速度和電滲速度的矢量和，電滲速度一般大于電泳速度，因此即使是陰離子也會從陽極端流向陰極端。第15頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四膠束電動毛細管色譜MEKC 膠束電動毛細管色譜MEKC指以加入了一定濃度表面活性劑的電解質溶液為介質的電泳，適宜分析電中性組分。 通常選擇加陰離子表面活性劑到緩沖溶液中，當濃度超過臨界膠束濃度，表面活性劑分子間的疏水基團聚集在一起，形成膠束。因為樣品中不同組分具有不同疏水性，使其進入膠束的機會不同，從而產生分配系數(shù)差異。 疏水性越強的組分

10、出峰時間越長。第16頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四毛細管凝膠電泳CGE毛細管凝膠電泳CGE，以凝膠或聚合物網絡為介質的毛細管電泳。分離范圍：從幾個堿基對到幾百萬個堿基對的以及蛋白質等大分子物質。消除電泳：毛細管改性，使粒子只產生電泳。介質分類：凝膠和線性聚合物不足：凝膠毛細管柱的制備比較繁瑣，使用壽命短。第17頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四毛細管等電聚焦CIEF 等電點:兩性物質以電中性狀態(tài)存在時的p，如氨基酸、蛋白質等，因為在等電點時組分成電中性，所以其電泳淌度為零，且溶解度最好。 毛細管等電聚焦（CIEF）：是一種以兩性電解質為介質，根據(jù)

11、等電點差別分離生物大分子的高分辨電泳。 首先，通過管壁涂層使定域電荷最小，以防止蛋白質依附及破壞穩(wěn)定的聚焦區(qū)帶。在高電壓下，建立p梯度。溶質在低于其等電點的區(qū)域呈正電性，向負極方向移動。反之，向正極移動，最后實現(xiàn)分離。第18頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四毛細管電色譜CEC 毛細管電色譜CEC：一種使用了特殊毛細管柱的毛細管區(qū)帶電泳，即用填充柱、整體柱或壁處理柱代替了開口毛細管柱。毛細管電色譜綜合了電泳和分配色譜兩種分離機制，既能分離帶電組分，又能分析中性分子，還可用于微量制備。第19頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四儀器裝置 毛細管電泳儀的裝置較

12、簡單，主要由高壓電源、毛細管、緩沖溶液、檢測器、工作站等部分組成。高級的儀器還具有自動進樣裝置、柱溫箱、餾分收集器、壓力系統(tǒng)和全自動控制儀器的工作站。第20頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四儀器裝置高壓電源：電壓強度一般控制在150-400V/cm毛細管: 長度 20cm 內徑 50*10-6、75*10-6 可分為涂層，和未涂層兩種。檢測器: 可調波長的紫外檢測器進樣裝置：分為壓力、重力、電動三種進樣方式壓力系統(tǒng)：在毛細管兩端加壓：防止氣泡產生 在毛細管一端加壓：可以在不使用電壓時進行毛細管高效 液相色譜分析。溫控系統(tǒng)：15-60，浮動小于0.1 .第21頁，共27頁，

13、2022年，5月20日，7點26分，星期四定性定量分析 定性參數(shù)：遷移時間或相對遷移時間。通過與標準品比對或增加峰高法進行定性分析。 定量參數(shù)：峰高。 在復雜體系中可用內標法或標準加入法進行定量分析。第22頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四 色譜圖色譜峰中的幾個參數(shù) 1 保留值 2 峰高H及峰面積A 3 區(qū)域寬度 ：峰寬及半峰寬第23頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四應用離子分析陽離子分析 遷移方向和電滲流方向一致； 4.5min內分離了24種金屬離子； 陽極進樣，陰極檢測； 具有很高的靈敏度；第24頁，共27頁，2022年，5月20日，7點26分，星期四陰離子分析 陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時間長、效率低； 質量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測； 加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內分離36種陰離子；陰極進樣，陽極檢測；離子價態(tài)及存在形態(tài)分析；第25頁，共27頁，2022年，5