能否用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定食品中的三聚氰胺課件

1、能否用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定食品中的三聚氰胺 ?第4小組成員： 陳琦、陳關(guān)鋒、陳朝暉 諸世楠、宣建鋒、連翔三聚氰胺（ C3N6H6 ） 三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，廣泛應(yīng)用于塑料、涂料、粘合劑、食品包裝材料生產(chǎn)。 三聚氰胺的含氮量高達(dá)66.6%，因此，三聚氰胺常被不法商人用作食品、飼料添加劑，以提升食品、飼料檢測(cè)中的蛋白質(zhì)含量指標(biāo)。 農(nóng)業(yè)部已明令禁止在飼料和食品中人為添加三聚氰胺，對(duì)非法在飼料中添加三聚氰胺的，依法追究法律責(zé)任。 Here comes your footer Page 2酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)三聚氰胺 目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)三聚氰胺的方法主要是高效液相色譜

2、法，確證方法是氣相質(zhì)譜聯(lián)用法，但這兩種方法比較復(fù)雜、耗時(shí)，而且檢測(cè)成本較高，會(huì)浪費(fèi)大量的人力物力。 而酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單，并可同時(shí)對(duì)大批量樣品進(jìn)行快速檢測(cè)的特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于食品中獸藥、毒素檢測(cè)的初篩中。 但是酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)樣品基質(zhì)反應(yīng)敏感，并非所有樣品都能夠采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行初篩。 Here comes your footer Page 3酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)三聚氰胺 為了確證酶聯(lián)免疫吸附法是否能成功應(yīng)用于不同的樣品基質(zhì)中，我們小組從網(wǎng)上選取了一個(gè)以美國(guó)Abraxis的三聚氰胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)奶制品、成品飼料、飼料原料、肉類等不同

3、的樣品基質(zhì)中的三聚氰胺含量進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn) 。 并根據(jù)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)三聚氰胺的可行性。Here comes your footer Page 4Abraxis三聚氰胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 檢測(cè)原理： 由于三聚氰胺為小分子抗原，本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法原理設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)。 樣品中的三聚氰胺與一定量的（辣根過(guò)氧化物酶 ）HRP標(biāo)記的三聚氰胺競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相上的三聚氰胺抗體，洗滌除去未結(jié)合的三聚氰胺和HRP標(biāo)記的三聚氰胺。加入底物溶液，結(jié)合在固相上的HRP將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)化為 藍(lán)色的物質(zhì)。樣品中三聚氰胺量 含量愈多，結(jié)合在固相上HRP標(biāo)記 的三聚氰胺愈少，最后的顯色也 愈淺，

4、OD值越低。Here comes your footer Page 6酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)三聚氰胺1. 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液 精確稱取10.05 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品至100 ml容量瓶中，用70%甲醇定容至100 ml，溶液中三聚氰胺的濃度為100 mg/kg，28保存。2.加標(biāo)樣品的制備 取已知陰性樣品。奶粉按0.5、1.0、2.5 mg/kg3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加;液態(tài)奶按1.0、2.5、5.0 mg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加;飼料基質(zhì)按2.0、3.0、4.0 mg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加;肉類基質(zhì)按1.0、2.0、3.0 mg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加。實(shí)驗(yàn)基本操作Here comes y

5、our footer Page 7酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)三聚氰胺4.測(cè)定程序 采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法(ELISA)，控制室溫(2025)，取出試劑盒（美國(guó)Abraxis的三聚氰胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒），室溫下放置以使試劑盒在使用前與室溫平衡。取出所需酶聯(lián)板的條數(shù)插入框架。 記錄下標(biāo)準(zhǔn)品、加標(biāo)樣、待測(cè)樣品的位置，并于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。并根據(jù)曲線圖計(jì)算出曲線方程。 根據(jù)曲線方程，代入酶標(biāo)儀測(cè)定的樣品的最大吸光的百分?jǐn)?shù)計(jì)算三聚氰胺含量，最后乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就是樣品中測(cè)定的濃度。Here comes your footer Page 9酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)三聚氰胺檢出限 為驗(yàn)證酶聯(lián)免疫試劑盒在

6、不同樣品基質(zhì)中的靈敏度，選取已由理化方法確證過(guò)的陰性空白樣品，對(duì)奶制品、成品飼料、飼料原料和肉類進(jìn)行了樣品測(cè)定，并每類基質(zhì)設(shè)計(jì)了1015個(gè)平行孔。 根據(jù)空白平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)定義檢出限，用于反映體系的檢測(cè)靈敏度。 Here comes your footer Page 10檢出限（RSD：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）Here comes your footer Page 11檢出限 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，本批次的Abraix三聚氰胺檢測(cè)試劑盒對(duì)奶制品中三聚氰胺檢測(cè)有著較為理想的結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)10%，并且能用于成品飼料、肉類基質(zhì)中的三聚氰胺的檢測(cè)(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差18.1%)。 而對(duì)飼料原料的檢

7、測(cè)，采用酶聯(lián)免疫法時(shí)，并不是所有的飼料原料都能滿足現(xiàn)時(shí)的限量需求，造成差異的可能原因應(yīng)該是飼料原料基質(zhì)的復(fù)雜性，破壞了整個(gè)酶聯(lián)免疫反應(yīng)體系。Here comes your footer Page 12回收率回收率 根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出樣品添加三聚氰胺的濃度減去空白樣檢測(cè)濃度(20g/L)除以實(shí)際添加的濃度，再乘以100%即為三聚氰胺的回收率。 Here comes your footer Page 13回收率 表2所示，酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)奶制品中的三聚氰胺檢測(cè)均具有較為良好的檢測(cè)能力，均滿足我國(guó)規(guī)定的臨時(shí)限量值的要求。Here comes your footer Page 14回收率表4表明：

8、檢測(cè)試劑盒對(duì)飼料原料中三聚氰胺的檢測(cè)靈敏度不能達(dá)到2.5mg/kg。因此其酶免試劑盒不適用于飼料原料中所有基質(zhì)的三聚氰胺的檢測(cè)。表5表明：回收率普遍偏低，其原因可能是系統(tǒng)誤差或者特定樣品基質(zhì)造成，在實(shí)際肉類檢測(cè)中，這種情況需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證。 Here comes your footer Page 16酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)三聚氰胺 三聚氰胺的ELISA進(jìn)口檢測(cè)試劑盒主要有美國(guó)Abraxis、Beacon以及Strategic Diagnostics公司的產(chǎn)品，其中Abraxis公司的三聚氰胺檢測(cè)試劑盒由于快速、可靠，在國(guó)內(nèi)應(yīng)用最為廣泛。 ELISA方法由于高通量、簡(jiǎn)單、快速，在食品檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛，但是該方法存在一定的假陽(yáng)性，只能作為一種篩選方法，其