新冠核酸檢測(cè)結(jié)果分析、報(bào)告與解釋（新冠肺炎核酸檢測(cè)學(xué)習(xí)專家課堂）

1、新冠核酸檢測(cè)結(jié)果分析、 報(bào)告與解釋新型冠狀病毒2020.1.12.WHO將2019年底新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒暫時(shí)命名為新 型冠狀病毒（2019 novel coronavirus, 2019-nCoV）2020.2.11.國(guó)際病毒分類委員會(huì)的冠狀病毒研究小組將新型冠 狀病毒正式命名為嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2（sever acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）2020.2.11.WHO將SARS-CoV-2引起的疾病稱為2019冠狀病 毒?。╟oronavirus disease 19, COVID-19）SARS-CoV-2的

2、病原學(xué)特點(diǎn)SARS-CoV-2是新發(fā)現(xiàn)的可感染人類的冠狀病毒屬于套式病毒目、冠狀病毒科、-冠狀病毒屬為單股正鏈有包膜的RNA病毒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60140nm。外膜有蘑菇狀蛋白刺突，使病毒形如王冠狀其基因組大約由29000個(gè)核苷酸組成其基因組序列與蝙蝠SARS樣冠狀病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21株序列同源性85%以上，S刺突蛋白含SARS-CoV相似的受體 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與2003年引起SARS的SARS-CoV同源性79.5%采用-CoV基因組中一個(gè)互補(bǔ)回文序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2可能來(lái)自菊頭蝠（Rhinolophus）SARS-C

3、oV-2的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)SARS-CoV-2基因組有12個(gè)開(kāi)放讀碼框（ORF），包括1ab、S、3、E、M、7、 8、9、10b、N、13、14ORF 1ab為RNA依賴的RNA聚合酶基因（RdRp）所在區(qū)域，編碼RNA聚合酶， 負(fù)責(zé)病毒核酸復(fù)制S區(qū)編碼刺突蛋白，與病毒感染能力相關(guān)，通過(guò)與細(xì)胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受 體結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞E區(qū)編碼囊膜蛋白，負(fù)責(zé)病毒包膜及病毒顆粒的形成M區(qū)編碼膜蛋白N區(qū)編碼核殼蛋白，與病毒基因組宿主RNA互相識(shí)別由于SARS-CoV-2的1ab基因區(qū)的RdRp基因在進(jìn)化樹(shù)上與SARS-CoV的RdRp基 因顯著不同，故被列為一種全新的屬冠狀病毒。因此，RdRp基因

4、也成為鑒定 SARS-CoV-2的重要標(biāo)志物。SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR法（qRT-PCR）：目前最常用的實(shí)驗(yàn)室診 斷SARS- CoV-2感染的方法（17個(gè)）恒溫?cái)U(kuò)增：即時(shí)檢測(cè)（POCT）（4個(gè)）基因測(cè)序：將測(cè)序結(jié)果與已知的SARS-CoV-2序列做同源性比對(duì)（1個(gè)）雜交捕獲法：1個(gè)已有23個(gè)獲NMPA批準(zhǔn)的新冠核酸檢測(cè)試劑（截至7.13）qRT-PCR法檢測(cè)SARS-CoV-2檢測(cè)原理：根據(jù)SARS-CoV-2基因序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，采 用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄多重RT-PCR法擴(kuò)增SARS-CoV-2基因和內(nèi)標(biāo)基因（常 用RNase P基因，非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)），定

5、性檢測(cè)樣本是否存在SARS- CoV-2。靶標(biāo)基因：1、2、3個(gè)不等，常為2個(gè)靶標(biāo)。核酸提取和擴(kuò)增：根據(jù)所用試劑的說(shuō)明書操作。樣本保存液、核酸提取 試劑應(yīng)與核酸擴(kuò)增試劑配套。有些核酸提取試劑易受胍鹽或保存液中特殊成 分的影響，影響核酸提取效果。質(zhì)控樣本：試劑空白、陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性質(zhì)控樣本擴(kuò)增儀參數(shù)設(shè)置以ABI Prism 7500和達(dá)安基因股份有限公司雙靶標(biāo)檢測(cè)試劑為例在熒光定量PCR儀上設(shè)置參數(shù)：設(shè)置探針檢測(cè)模式：Reporter1：FAM（N基因），Quencher 1：NONE； Reporter 2：VIC（ORF1ab基因），Quencher 2：NONE； Reporter3：

6、Cy5（內(nèi)標(biāo)基因），Quencher3：NONE；Passive Reference：NONE設(shè)置樣本檢測(cè)位置：打開(kāi)“Setup”窗口，按樣本對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品（NTC）、陽(yáng)性質(zhì)控品以及未知樣本（Unknown），并在“Sample Name”一欄中設(shè)置樣本號(hào)設(shè)置擴(kuò)增條件：打開(kāi)“instrument”窗口，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書設(shè)置循環(huán)條件PCR循環(huán)條件的設(shè)置設(shè)置完成后，保存文件（年月日+項(xiàng)目+批次），運(yùn)行程序。擴(kuò)增結(jié)果分析流程擴(kuò)增結(jié)束后保存結(jié)果將原始擴(kuò)增曲線由對(duì)數(shù)圖譜轉(zhuǎn)換為線性圖譜，對(duì)每個(gè)檢測(cè)基因（ORF1ab、N、內(nèi)標(biāo)）分別進(jìn)行分析，分別調(diào)節(jié)其基線和閾值，點(diǎn) 擊Analysis獲得分析結(jié)果先

7、分析質(zhì)控樣本結(jié)果，再分析臨床樣本結(jié)果應(yīng)分析每個(gè)樣本的所有擴(kuò)增曲線在“Report”窗口讀取檢測(cè)結(jié)果結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：ORF1ab和N基因Ct值40，且有明顯的S型擴(kuò)增曲線陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)：ORF1ab和N基因無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值40，且內(nèi)對(duì)照 有擴(kuò)增曲線可疑判斷標(biāo)準(zhǔn)：ORF1ab和N區(qū)，僅有其中一個(gè)Ct值40，且有明顯的 S型擴(kuò)增曲線復(fù)檢規(guī)則：對(duì)于檢測(cè)結(jié)果可疑的樣本，進(jìn)行復(fù)檢。若復(fù)檢結(jié)果一致，判斷樣品為新型 冠狀病毒陽(yáng)性；若復(fù)檢均為陰性，判斷為未檢測(cè)到新型冠狀病毒RNA。靶基因和內(nèi)標(biāo)均無(wú)擴(kuò)增曲線，進(jìn)行復(fù)檢。陽(yáng)性樣本采用第二種試劑復(fù)檢，或用靈敏度更高的試劑或方法復(fù)檢?；€（baseline）：

8、產(chǎn)物積累的熒光信號(hào)能被儀器檢測(cè)到的最下限。循環(huán)閾值(cycle threshold, CT)20200427第8批N基因擴(kuò)增結(jié)果20200427第8批ORF1ab基因擴(kuò)增結(jié)果20200427第8批內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增結(jié)果20200427第8批陽(yáng)性質(zhì)控品20200427第8批弱陽(yáng)性質(zhì)控品（衛(wèi)健委提供，不帶內(nèi)標(biāo)）20200427第8批試劑空白20200427第8批陰性質(zhì)控品0424第2批臨床樣本內(nèi)標(biāo)弱陽(yáng)性，復(fù)查20200713第6批H8內(nèi)標(biāo)未擴(kuò)增， 復(fù)查20200420第2批內(nèi)標(biāo)基因結(jié)果試劑空白和弱陽(yáng)性質(zhì)控品內(nèi)標(biāo)污染20200427第13批內(nèi)標(biāo)基因結(jié)果 弱陽(yáng)性質(zhì)控品內(nèi)標(biāo)污染20200425第1批陽(yáng)性質(zhì)控品

9、結(jié)果（右圖）靶標(biāo)基因Ct值降低34，內(nèi)標(biāo)基因Ct值大于40，陽(yáng)性質(zhì)控品失控20200708試劑空白的擴(kuò)增曲線全國(guó)第二次室間質(zhì)評(píng)N、 ORF1ab和內(nèi)標(biāo)結(jié)果N基因結(jié)果ORF1ab結(jié)果內(nèi)標(biāo)結(jié)果結(jié)果報(bào)告報(bào)告中應(yīng)有以下基本信息： 患者姓名、性別、年齡、標(biāo) 本類型、診療卡號(hào)、條碼號(hào)、 科別、床號(hào)、檢測(cè)方法、標(biāo) 本接收時(shí)間、報(bào)告時(shí)間、檢 測(cè)者和審核者簽名等。結(jié)果解釋報(bào)告方式：陰性/陽(yáng)性或檢出/未檢出，應(yīng)統(tǒng)一陰性或未檢出的解釋：患者沒(méi)有感染新冠病毒或檢測(cè)樣本中的病 毒載量低于試劑檢測(cè)限陽(yáng)性的解釋：患者感染了新型冠狀病毒臨床高度懷疑新冠病毒感染而檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)，建議重新采集或 更換部位采集樣本重測(cè)應(yīng)避免報(bào)告不

10、規(guī)范，如病毒名稱寫為COVID-19陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)在12h內(nèi)進(jìn)行傳染病上報(bào)和后續(xù)流行病學(xué)調(diào)查工作報(bào)告時(shí)限發(fā)熱門診、急診 患者6小時(shí)內(nèi)普通門診、住院 患者和陪護(hù)人員12小時(shí)內(nèi)愿檢盡檢人群24小時(shí)內(nèi)臨床假陰性問(wèn)題即臨床高度疑似COVID-19（臨床癥狀和影像學(xué)支持），而新冠 核酸檢測(cè)結(jié)果多次或始終陰性。其原因如下：患者體內(nèi)病毒載量低，樣本中的病毒量達(dá)不到試劑的最低檢測(cè)限所使用的病毒核酸檢測(cè)試劑靈敏度不夠高實(shí)驗(yàn)室未嚴(yán)格遵循臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量管理，如樣本滅活以后未 及時(shí)進(jìn)行核酸提取、核酸提取程序未用標(biāo)準(zhǔn)程序等樣本的質(zhì)量問(wèn)題，是否規(guī)范采集、是否采集到含病毒的細(xì)胞病毒在流行過(guò)程中發(fā)生基因突變，可能導(dǎo)致假陰性與疾病進(jìn)程有關(guān)，疾病不同階段不同檢測(cè)樣本的陽(yáng)性率不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的假陰性所采集樣本中病毒載量高于所用檢測(cè)試劑的檢測(cè)限，而實(shí)驗(yàn)室確沒(méi)有檢出。需要實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)