黃水芽胞桿菌抗逆性潛力挖掘及乙醇耐受機(jī)制分析

1、黃水芽胞桿菌抗逆性潛力挖掘及乙醇耐受機(jī)制分析濃香型白酒是中國(guó)白酒典型代表之一，市場(chǎng)份額占全國(guó)白酒總量的70%以上1。根據(jù)GB/T 10781.12022 濃香型白酒，濃香型白酒以糧谷為原料，經(jīng)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，未添加食用酒精及非白酒發(fā)酵產(chǎn)生的呈香物質(zhì)，以已酸乙酯為主體復(fù)合香。微生物在白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮重要作用，處于核心地位，能夠產(chǎn)生多種生物酶和香味成分及其前體物質(zhì)，參與淀粉糖化、酒精發(fā)酵、產(chǎn)酯生香等生化過(guò)程，對(duì)白酒獨(dú)特風(fēng)味的形成具有重要作用2?？鼓嫘允轻勗煳⑸镞m應(yīng)白酒發(fā)酵過(guò)程、發(fā)揮功能特性的基礎(chǔ)。芽胞桿菌是白酒發(fā)酵過(guò)程中大曲、窖泥和酒醅中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，在大曲發(fā)酵的中后期開(kāi)始大

2、量繁殖，并成為優(yōu)勢(shì)種群。與其他微生物相比，芽胞桿菌除具有產(chǎn)生生物酶、氨基酸、風(fēng)味物質(zhì)等代謝物功能特性外，通常具有耐酸、耐鹽、耐高溫、耐膽鹽等顯著特征3-4，以適應(yīng)復(fù)雜多變的發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境。黃水是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)濃香型大曲酒的副產(chǎn)物，為棕黃色黏稠液體，含有多種酸類(lèi)、醇類(lèi)等呈香味物質(zhì)以及經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化的有益微生物5。實(shí)驗(yàn)室前期從四川省宜賓地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵濃香型白酒的黃水樣品中分離到1株黃水芽胞桿菌(Bacillusaquiflavi)3H-106，具有較好的產(chǎn)蛋白酶活力，可產(chǎn)生苯甲醛、正丁醇、已酸乙酯等多種代謝風(fēng)味物質(zhì)，且通過(guò)全基因組測(cè)序分析顯示，菌株在抗生素耐藥性、產(chǎn)毒與致病性方面風(fēng)險(xiǎn)較低。本研究對(duì)黃水芽胞

3、桿菌3H-10進(jìn)一步開(kāi)展乙醇、酸、堿、NaCl和溫度等耐受性潛力挖掘，并結(jié)合菌種全基因組序列分析解析菌種潛在耐受機(jī)制，為該菌株應(yīng)用于濃香型白酒發(fā)酵的實(shí)際生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。2.6 黃水芽胞桿菌3H-10乙醇代謝途徑分析KEGG分析顯示，菌株黃水芽胞桿菌3H-10基因組中含有1個(gè)乙醇脫氫酶基因adh和3個(gè)乙醛脫氫酶基因aldh，分別編碼乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH), EC1.1.1.1和乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH), EC.1.2.1.3，組成較完整的乙醇脫氫酶系(圖2)。ADH和ALDH參與催化乙醇的分解代謝，乙醇通過(guò)A

4、DH氧化成為乙醛，乙醛通過(guò)ALDH氧化成為乙酸，乙酸進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，最終氧化成CO2和水。其中，ADH是乙醇代謝的重要限速酶之一，一般為以氧化型輔酶(NAD+)、氧化型輔酶II(NADP+)或吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，P)為輔酶的鋅金屬酶，具有廣泛的特異性，是許多有機(jī)體中短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，可逆催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應(yīng)的羧基化合物。ALDH是生物體內(nèi)用于降解乙醛的重要酶類(lèi)，以NADP+為輔酶的含鋅類(lèi)酶，催化包括乙醇在內(nèi)的某些物質(zhì)以及二級(jí)醇、醛和酮的脫氧反應(yīng)。ADH和ALDH廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物體中，其代謝活性直接影響生物體內(nèi)乙醇的代謝，從而對(duì)生

5、物體的生理狀態(tài)產(chǎn)生直接影響。鞠建松等15將假堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌中adh和aldh進(jìn)行克隆并異源表達(dá)，能夠較大程度提高宿主對(duì)乙醇的耐受性。此外，黃水芽胞桿菌3H-10基因組中還含有1個(gè)乙醛脫氫酶(EC1.2.1.10)，可催化乙醛生成乙酰輔酶A，后者進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，協(xié)助促使乙醇代謝，最終氧化成CO2和水。圖2 黃水芽胞桿菌3H-10中的乙醇代謝途徑Fig.2 The alcohol metabolism pathway inB.aquiflavi3H-102.7 黃水芽胞桿菌3H-10乙醇耐受相關(guān)基因的定向檢索目前關(guān)于芽胞桿菌乙醇耐受性的研究仍相對(duì)較少，微生物類(lèi)群以枯草芽胞桿菌14-15為主。具有乙醇

6、耐受特性的微生物當(dāng)前主要集中在釀酒酵母16-19、大腸埃希氏菌20-21和惡臭假單胞菌22等，其耐受乙醇的機(jī)制主要包括：(1)提高糖類(lèi)和氨基酸等轉(zhuǎn)運(yùn)能力；(2)利用排出泵將有機(jī)溶劑排出細(xì)胞；(3)合成和積累海藻糖與脯氨酸等，減少膜的滲透性改變；(4)合成氨基酸等。將相關(guān)基因在黃水芽胞桿菌3H-10基因組中進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株不含有這些基因(表2)。說(shuō)明上述機(jī)制不是黃水芽胞桿菌3H-10耐受乙醇的主要原因。表2 已報(bào)道的乙醇耐受相關(guān)基因在黃水芽胞桿菌3H-10基因組中的檢測(cè)結(jié)果Table 2 The detection result of reported genes related w

7、ith alcohol tolerance in the genome ofB.aquiflavi3H-10芽胞桿菌作為白酒發(fā)酵過(guò)程中的重要微生物類(lèi)群往往對(duì)乙醇等極端環(huán)境具有一定耐受性，對(duì)其機(jī)制的研究能夠?yàn)榫陸?yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，值得深入探討。本研究首次對(duì)我國(guó)四川省宜賓地區(qū)首株釀酒微生物新種菌株黃水芽胞桿菌3H-10乙醇耐受機(jī)制進(jìn)行解析，為后續(xù)相關(guān)研究提供了參考。3 結(jié)論黃水芽胞桿菌3H-10是從濃香型白酒發(fā)酵樣品黃水中分離的1株芽胞桿菌，具有顯著的產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力，在抗生素耐藥性、產(chǎn)毒與致病性方面安全性風(fēng)險(xiǎn)較低，在白酒發(fā)酵過(guò)程中具有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。本文從乙醇、酸、堿、NaCl和溫度等方面對(duì)黃水芽胞桿菌3H-10的抗逆性潛力進(jìn)行挖掘，并探究其抗逆性潛在機(jī)制。結(jié)果顯示，菌株可在4%乙醇環(huán)境生長(zhǎng)，對(duì)乙醇具有一定耐受性?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)，菌株含有數(shù)量較多的HSP編碼基因，可通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)減弱乙醇對(duì)細(xì)胞的毒害作用；菌株基因組中含有完整的乙醇代謝途徑相關(guān)