乳酸菌的提取和鑒定

1、酸奶中乳酸菌的篩選試驗一、實驗目的：熟悉從酸奶中分離和純化乳酸菌的一般方法二、實驗原理：市場銷售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛 奶中乳糖發(fā)酵成乳酸 ，此外酸奶中還含有其他球菌，利用 它產(chǎn)酸等 性質(zhì)可以分離乳酸菌，分離培養(yǎng)基一般添加 蛋白 胨、酵母膏提供氮源、維生素、生長因子；葡萄糖為可發(fā)酵 糖類；磷酸氫二鉀為酸堿緩沖劑；檸檬酸銨、硫酸鎂、硫酸 錳、亞硫酸鐵、吐溫-80 和乙酸鈉為培養(yǎng)各種乳酸菌提供生 長因子，其成分還能抑制某些雜菌；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固 劑。、也常常加入醋酸鹽，因醋酸鹽能抑制部分細菌生長， 對乳酸菌無害。培養(yǎng)基中添加碳酸鈣，乳酸溶解培養(yǎng)基中的 碳酸鈣形成透明圈，作為分

2、離鑒別的依據(jù)。.篩選方法：.溶鈣圈法：利用一些產(chǎn)酸類細菌在含 CaCO3 的 培養(yǎng)基上產(chǎn)生 CaCO3 溶解圈，從而篩選出這些產(chǎn)酸類細 菌，可用于乳酸菌的篩選。其中培養(yǎng)基中加入 CaCO3 的作 用是：鑒別能產(chǎn)生酸的細菌；中和產(chǎn)生的酸，以維持培 養(yǎng)基的PH、更利于乳酸菌的生長和分離三、實驗藥品及儀器 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐溫-80、檸檬酸二銨、CaCO3 、K2HPO4 NaAc3H2O、MgSO47H2O、 MnSO4H2O、瓊脂、結(jié)晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蠟、 蒸餾水。儀器：超凈工作臺、電子顯微鏡、接種環(huán)、恒溫培養(yǎng)箱、接種環(huán)、培養(yǎng)皿、涂布環(huán)、高壓鍋、試管、微波爐、

3、電子天平、 離心機四培養(yǎng)基類型 改良 MRS 培養(yǎng)基（乳酸菌分離培養(yǎng)基）：牛肉膏 10g ， 蛋白胨10g,酵母膏5g,葡萄糖20g，吐溫-80 1.0ml （它是 一種很好的乳化劑和分散劑 也就是說它的作用就是是培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分更加的均勻 就 是對營養(yǎng)成分的再一次優(yōu)化）K 2HPO4 2g, NaAc3H2O 5g 檸 檬酸二銨 2g，MgSO47H2O 0.58g， MnSO4H2O 0.25g，補 蒸餾水至1000ml （固體培養(yǎng)基中加瓊脂1.5%-2%），調(diào)pH 至 6.40.2, 121 C 高壓滅菌 15min改良MC培養(yǎng)基（乳酸菌選擇培養(yǎng)基）：牛肉膏5g,蛋 白胨5g,酵母膏5g

4、,葡萄糖20g,乳糖20g, CaCO3 10g, 瓊脂20g，中性紅0.05g （指示劑），最終pH6.50.2,補 蒸餾水至1000ml, 121C高壓滅菌15min。配制方法： 1 把除 CaCO3 以外的成分稱量溶解后.調(diào) PH 至6.2 6.4；稱取20g CaCO3加入到100mL蒸餾水中，制成CaCO3乳濁液；將培養(yǎng)基和CaCO3乳濁液分開滅菌；倒平板前,待培養(yǎng)基融化冷卻后,平板上加入一定量的CaCO3 乳濁液,晾干了以后再接種。1、21、2、3、4、吸取酸奶 1ml10 倍梯度稀釋平板涂布（改良 MC Medium）厭氧培養(yǎng)（28 C培養(yǎng)48h）待形成菌落挑取溶鈣圈較大的單菌落

5、觀察、記錄菌落形態(tài)與特征5、Improved MC Medium 劃線分離純化6、選取溶鈣圈較大的單菌落進行G+染色7、革蘭氏陽性菌（G+菌）記錄菌株細胞形態(tài)9、MRS液體培養(yǎng)（37 C培養(yǎng)48h具體步驟：（ 1）按要求做好培養(yǎng)基（ 1）無菌操作將經(jīng)過充分搖勻的檢樣 20mL ，放入含有 180mL 滅菌生理鹽水的滅菌三角瓶內(nèi)，振搖均勻，即為 1：10 稀 釋液，依次做1: 100、1： 1000稀釋。10倍梯度稀釋至10-6濃度（2）取每個稀釋度的溶液2 mL分別傾倒在準備好的改良MC培 養(yǎng)基上，每個稀釋度兩個平板，用涂步環(huán)涂布，用石蠟油密 封培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，42C培養(yǎng)48h（ 3）待形成菌

6、落后，選取表面濕潤、形態(tài)飽滿、溶鈣圈較明顯較 大的單菌落（圖2-12）在改良MC培養(yǎng)基上進行劃線純化（ 4 ）劃線純化后挑取溶鈣圈較大、形態(tài)飽滿表面濕潤的單菌落進 行接種試管斜面6個，試管口用石蠟封口，37C厭氧培養(yǎng)18 小時。（5）從試管上取單菌落進行革蘭氏染色，確定是否為G+ 涂片固定 染色：初染（結(jié)晶紫染色液染色2-3分鐘，用蒸餾水沖洗）媒染（碘液1-2分鐘水洗）脫色（用95%乙醇沖洗 玻片2-3次，然后用蒸餾水沖洗） _復染（番紅,后水洗） 鏡檢：在顯微鏡下畫出菌體形態(tài)特征，確定是否為純菌株（6）把試管里的菌體用接種環(huán)轉(zhuǎn)移到已配置好的改良MRS液體 培養(yǎng)基上，三角瓶要用石蠟密封，37C培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)48小時。（7）取菌株培養(yǎng)液用離心機離心分離，3500r/min,15min，收集菌