蛋白質(zhì)免疫印跡技術詳解

1、蛋白質(zhì)免疫印跡技術詳解1第1頁一、Western Blot 介紹二、Western Blot 普通流程三、Western Blot 成像系統(tǒng)四、Western Blot 常見問題分析主要內(nèi)容2第2頁一、Western Blot 基本原理3第3頁一、Western Blot 優(yōu)點高分辨率電泳技術特異敏感抗原-抗體反應1-5ng中等大小靶蛋白4第4頁一、Western Blot 應用目標蛋白表示特征分析目標蛋白與其它蛋白、RNA互作 5第5頁蛋白樣品制備SDS電泳轉(zhuǎn)膜（PVDF或NC膜） 封閉一抗 洗滌酶標二抗反應洗滌顯影 二、Western Blot普通流程6第6頁LB： 62.5 mmol/L

2、 Tris-HCl （pH6.8 at 25）, 2%SDS ，10%Glycerol(甘油) ，50 mmol/L DTT(二硫蘇糖醇) ；溴酚藍在裂解液中加入適當?shù)鞍酌敢种苿?，防止蛋白降解，從而確保檢測準確性！蛋白樣品制備7第7頁8SDS是一個很強陰離子表面活性劑，它能夠斷開分子內(nèi)和分子間氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子二級和三級結構。 強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）能夠斷開二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)四級結構。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷蛋白質(zhì)-SDS 膠束。蛋白質(zhì)電泳遷移率主要決定于亞基相對分子質(zhì)量，而與其形狀及所帶電荷性質(zhì)無關。蛋白樣品制備第8頁蛋

3、白質(zhì)-SDS膠束特點：（1）含有相同形狀，形狀像一個長橢圓棒;（2）平均1g蛋白質(zhì)結合 1.4gSDS;（3）短軸對不一樣蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同;（4）長軸長度則與亞基分子量大小成正比;9第9頁Bradford法：考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不一樣顏色形式，在一定濃度乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色溶液，與蛋白結合后形成藍色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白濃度高低成正比 。雙縮脲法：Cu2+與蛋白質(zhì)肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波優(yōu)點有最大吸收Lowly法：第一步就是雙縮脲反應，即Cu2+與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡合物

4、，然后這個絡合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），結果得到深藍色物。蛋白樣品定量10第10頁不連續(xù)電泳緩沖體系。SDS-蛋白質(zhì)復合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量大小。11聚丙烯酰胺凝膠電泳第11頁不連續(xù)電泳系統(tǒng)作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl 低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，依據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸系統(tǒng)12第12頁聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel，簡稱PAG): 單體 丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr) 交聯(lián)劑 N,N-甲叉雙丙烯酰胺

5、加速劑 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化劑 過硫酸銨三維網(wǎng)狀結構凝膠，該凝膠化學惰性強，含有一定機械強度和透明度，是良好電泳介質(zhì)，以此凝膠為支持物電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠電泳13第13頁凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431020-807.536-945.057-21214第14頁15第15頁灌制分離膠隔絕空氣ddH2O乙醇16第16頁灌制濃縮膠插入梳子17第17頁Staking gelSeparating gel上樣18第18頁電泳

6、19第19頁轉(zhuǎn)膜半干法 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣夾在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。濕法 將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置緩沖液中，電轉(zhuǎn)4h或過夜。20第20頁膜選擇PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白質(zhì)印跡法中慣用一個固相支持物。PVDF膜是疏水性，膜孔徑有大有小，伴隨膜孔徑不停減小，膜對低分子量蛋白結合就越牢靠。大于20KD蛋白選取0.45um膜，小于20KD蛋白選取0.2um膜。預處理，用甲醇處理目標是活化膜上正電基團，使其更輕易與帶負電蛋白結合。21第21頁濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)22第22頁轉(zhuǎn)膜23蛋白x(kDa)轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)膜條件x20甘氨酸（0

7、.2M），3.0gTris堿（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），用水定容至。250mA恒流轉(zhuǎn)3 hrs20 x120配方同上250mA恒流4 hrs120 x200甘氨酸（0.2M），3.0gTris堿（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），0.05%SDS，用水定容至。250mA恒流轉(zhuǎn)6 hrs200 x配方同上500mA恒流轉(zhuǎn)4 hrs不一樣大小蛋白轉(zhuǎn)膜條件：23第23頁半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)24第24頁封閉為防止作為檢測試劑特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結合而使非特異性背景提升,需對膜上潛在結合位點進行封閉處理。脫脂奶粉（5）、BSA（1）25第25頁一抗、二抗孵育加入

8、一抗溶液與濾膜溫育，372小時或4 過夜?；厥找豢谷芤海肨BST漂洗液濾膜3次，每次5min。加入用TBST配制二抗，搖床上遲緩搖動， 室溫孵育1-2小時。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次5min，最終一次用TBS。26第26頁二抗與底物反應顯色化學發(fā)光顯色法(HRP)ECL中l(wèi)uminol被HRP和H2O2氧化，產(chǎn)生熒光，這個過程被發(fā)光增強劑加強影響發(fā)光原因主要有： 1.含HRP抗體； 2.發(fā)光試劑； 3.反應雜質(zhì);27第27頁洗脫抗體一抗洗脫二抗洗脫一抗種屬起源不一樣時，strip二抗即可28第28頁三、顯色暗室曝光Tanon 5200 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)29第29頁

9、Tanon 5200性能特點適合用于高分辨率和高靈敏度圖像拍攝；可設定連續(xù)采樣次數(shù)、起始及終止曝光時間，進行動態(tài)連續(xù)拍攝，拍攝得高質(zhì)量圖片；30第30頁Tanon 5200軟件特點31含有序列圖像保留功效，無需單張圖片分別存放；含有分析軟件，可進行泳道密度掃描、半定量計算，分子量計算；圖像疊加分析功效：可對兩個圖像進行合并顯示，并進行分析；第31頁膠不平？凝膠漏液？ 膠板洗刷潔凈 加入AP和TEMED量要適當加入試劑后搖勻，使其充分混合，預防部分膠塊聚合不均勻溫度適當，受熱不均勻造成膠聚合不均勻 兩塊玻璃板底部要對齊四、SDS常見問題對 策32第32頁條帶比正常窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡可能混合均勻，動作輕緩拔梳子要快速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其它條帶造成寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否適當對 策四、SDS常見問題33第33頁凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長久使用造成海綿變薄，“三明治”結構不緊湊造成。確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫對 策四、SDS常見問題34第34頁1.膜沒有均勻浸濕2.