CF熒光定量PCR儀操作指南(Bio-rad)

1、(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)CFX96CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀操作流程及留意事項(xiàng)開頭運(yùn)行儀器翻開電腦翻開定量 PCRCFX Manager放置樣品將 PCR 反響體系參加到 0.2ml 低緣八聯(lián)管,蓋上管蓋;或參加低緣 96 孔板,用光學(xué)級(jí)封膜封好。留意,必需帶一次性塑料手套,不要讓手指接觸到反響管外表。將反響管按挨次放入儀器的加熱孔中.設(shè)置程序，運(yùn)行試驗(yàn)PCRa。 設(shè)置熱循環(huán)程序文件(Protocol Tab b。設(shè)置反響板文件(Plate Tab. C.點(diǎn)擊“Start Run”鍵，運(yùn)行程序熱循環(huán)程序文件Protocol Tab設(shè)置指南：點(diǎn)擊 Edit編輯或

2、 Create New創(chuàng)立程序.反響板設(shè)置文件Plate Tab設(shè)置指南：選擇本次試驗(yàn)所要使用的熒光染料種類;單擊樣品類型;如要某些反響孔第一熒光染料對(duì)應(yīng)的樣品類型為標(biāo)準(zhǔn)品(Standard,點(diǎn)擊“DilutionSeries”鍵可設(shè)置其標(biāo)準(zhǔn)品濃度及稀釋倍數(shù)。點(diǎn)擊“Start Runopen lidClose lid關(guān)閉熱蓋Start Run，保存文件，開頭運(yùn)行程序。結(jié)果分析PCRCt點(diǎn)擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結(jié)果報(bào)告單關(guān)閉運(yùn)行儀器試驗(yàn)完畢后取出反響管，挨次關(guān)閉 CFX Manager 軟件、定量 PCR 儀電源，關(guān)閉電腦。留意！CFX 儀器上蓋局部為全自動(dòng)把握，在通電狀態(tài)，嚴(yán)禁

3、任何人為干預(yù)上蓋開啟或關(guān)閉的行為，此類行為會(huì)導(dǎo)致上蓋故障，危及儀器使用。(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager試驗(yàn)操作程序設(shè)置圖 1 顯示試驗(yàn)設(shè)置窗口中一個(gè)預(yù)覽的程序。點(diǎn)擊 CreateNew，翻開程序編輯器創(chuàng)立一個(gè)的程序。點(diǎn)擊 SelectExisting，通過掃瞄器加載一個(gè)程序或?qū)ζ溥M(jìn)展編輯。使用 Express Load Edit Selected,翻開程序編輯器編輯所選程序的各個(gè)步驟。點(diǎn)擊 Start Run開頭運(yùn)行當(dāng)前加載的程序。程序編輯器程序編輯器可用來創(chuàng)立一個(gè)程序或編輯一個(gè)已存在的程序，圖 2。1在圖形或文本模式下選擇任何需要編輯的一步(該步驟會(huì)用

4、藍(lán)色高亮顯示)，點(diǎn)擊溫度或保持時(shí)間進(jìn)展直接編輯。 2點(diǎn)擊 Insert Step在程序中增加一個(gè)溫度步驟。點(diǎn)擊 Delete Step在程序中刪除選中的步驟.(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)點(diǎn)擊 Add Plate Read to Step,在程序中指定獵取熒光數(shù)據(jù)的時(shí)間。假設(shè)當(dāng)前的高亮顯示步驟已經(jīng)進(jìn)展了讀板設(shè)置，則這一選項(xiàng)變?yōu)?RemovePlateRead.假設(shè)在這一步不想獵取數(shù)據(jù)，則點(diǎn)擊 RemovePlateRead.點(diǎn)擊 GOTO 步驟的重復(fù)次數(shù)，轉(zhuǎn)變程序中的循環(huán)次數(shù)，圖 2 第 4 步。點(diǎn)擊 GOTO 步驟數(shù)可轉(zhuǎn)變 GOTO的步驟.增加一個(gè)梯度步驟：在程序編輯把握窗

5、口中，點(diǎn)擊 Insert Gradient,圖 2.對(duì)梯度中最低和最高溫度值進(jìn)展編輯,在圖形模式，文本模式下或消滅在文本模式右側(cè)的梯度范圍計(jì)算器中直接點(diǎn) 擊數(shù)值進(jìn)展編輯，圖 3.在梯度范圍計(jì)算器中，對(duì)任何一行都可以賜予一個(gè)指定的溫度.每行的溫度都會(huì)調(diào)整為適宜的溫度來滿足指定的溫 度范圍。增加熔解曲線：1在程序編輯把握窗口中，點(diǎn)擊 Insert Melt Curve ，圖 2。2在圖形或文本顯示模式下，點(diǎn)擊溫度值來編輯融解曲線范圍的最低和最高溫度，圖 4 第 5 步。(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)點(diǎn)擊增量值來編輯數(shù)據(jù)獵取的溫度區(qū)間。點(diǎn)擊保持時(shí)間編輯每一個(gè)增量溫度的保持時(shí)間。(完

6、整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager定量分析數(shù)據(jù)掃瞄擴(kuò)增圖表可以顯示試驗(yàn)中每個(gè)循環(huán)每個(gè)孔收集的相對(duì)熒光信號(hào)曲線。點(diǎn)擊位于擴(kuò)增圖表下方的熒光檢查窗，選擇需要11。選中的孔是藍(lán)色的，未選中的孔是亮數(shù)據(jù)分析選項(xiàng) CFXManager Settings Threshold 可以轉(zhuǎn)變基線范圍。軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算基線的位置?？梢渣c(diǎn)擊并拖動(dòng)閥值線來手動(dòng)定位.點(diǎn)擊工具欄中 View/Edit Plate按鈕來編輯孔的內(nèi)容，可以臨時(shí)創(chuàng)立的分群，從分析中增加或刪掉一些孔。圖表選項(xiàng)可用鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊任何圖表來復(fù)制或保存圖像，或選擇 Chart Options 來轉(zhuǎn)變軸范圍或刪除柵格,圖 2.

7、點(diǎn)擊工具欄中 Trace Styles 按鈕，或鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊任何圖表來設(shè)定制定孔的熒光信號(hào)曲線顏色。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊任何圖表,向下(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)和拖動(dòng)光標(biāo)可以放大圖表?？椎姆秩簲?shù)據(jù)掃瞄使用工具欄中 Select Well Group 下拉菜單來掃瞄指定孔的分群數(shù)據(jù)，圖 3.軟件可以針對(duì)每個(gè)分群作為獨(dú)立的試驗(yàn)來處理,每一個(gè)分群可針對(duì)自己的設(shè)置進(jìn)展分析，如進(jìn)展自身標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析。定量數(shù)據(jù)分析顯示選項(xiàng)點(diǎn)擊數(shù)據(jù)分析窗口中 Quantitation Data，掃瞄數(shù)據(jù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，包括每個(gè)孔的閥值 CT 和平均值以及復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)偏差，圖 4。點(diǎn)擊任一列的標(biāo)題進(jìn)展基于列的行分類。

8、鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊電子表格并選擇 Sort 可進(jìn)展基于多個(gè)列的行分類。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊任一列的標(biāo)題并向左或向右拖動(dòng)可以重排列電子表格中列的挨次。鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊電子 表格,選擇數(shù)據(jù)輸出格式如 text，XML 或 Excel 輸出數(shù)據(jù),圖 4。從 Quantitation Data 下拉菜單中選擇 Plate，在反響板柵格模式下顯示所選熒光的孔數(shù)據(jù).創(chuàng)立報(bào)告顯示選項(xiàng)點(diǎn)擊數(shù)據(jù)分析窗口工具欄中 Report 按鈕,圖 1,翻開 Report 窗口，圖 5。點(diǎn)擊報(bào)告選項(xiàng)列表中的檢查窗，使制定信息包含5 File并選擇 SavePDF格式保存報(bào)告,或選擇Print打印報(bào)告.也可以保存報(bào)告為其它的文件格式.(完整)C

9、FX 熒光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量把握,您可以使用 Gene Expression Module of CFX Manager 軟件來評(píng)估樣品之間靶標(biāo)濃度的相對(duì)差異。這種應(yīng)用最常用的使用是評(píng)估 cDNA 樣品中靶標(biāo)的濃度來推斷其 mRNA 水平。通常，一個(gè)或多個(gè)參照基因的含量被用來衡量目標(biāo)基因的水平。參照基因用來校正上樣的差異或各樣品取樣的差異。通過生物學(xué)條件的爭辯，參照基因的表達(dá)水平通常不 發(fā)生變化.基因表達(dá)分析設(shè)置圖 1 顯示各樣品孔含單一的熒光，四個(gè)復(fù)制類群，包含兩個(gè)不同靶標(biāo)名稱和兩個(gè)不同的樣品名稱。指定參照基因點(diǎn)擊反響板編輯器中 Experime

10、nt Settings 或 Gene Expression Module,翻開試驗(yàn)設(shè)置窗口,圖 2.選擇 Targets。3點(diǎn)擊適宜的檢查窗選擇將被使用為參照基因的靶標(biāo)。點(diǎn)擊 Show Analysis Settings 檢查窗，為靶標(biāo)設(shè)置反響擴(kuò)增效率。Auto Efficiency 檢查窗被默認(rèn)設(shè)定.假照試驗(yàn)中運(yùn)行一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到的擴(kuò)增效率將在計(jì)算中被使用.或者對(duì)適宜的靶標(biāo)輸入指定反響擴(kuò)增效率值,則計(jì)算中將使用這一擴(kuò)增效率值。指定比照樣本(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)在 Experiment Settings窗口，選擇 Samples標(biāo)簽。31，同時(shí)全部其

11、他樣本相對(duì)于比照樣本的值會(huì)被顯示出來.從 Mode4：a.NormalizedExpression Ct-靶標(biāo)基因的相對(duì)量可通過樣本的參照基因來進(jìn)展相對(duì)量的衡量.(完整)CFX 熒光定量PCR(Bio-rad)b。相對(duì)量Ct-靶標(biāo)基因的相對(duì)量不能被衡量；結(jié)果顯示的是試驗(yàn)中靶標(biāo)基因相對(duì)于其他樣品的基因濃度.圖形選項(xiàng)Graph Data Graph Data 選項(xiàng)默認(rèn)是比照相關(guān)。X 軸下拉菜單中選擇 X 軸以 Sample 顯示或 TargetY 軸下拉菜單中選擇 Linear,Log2 或 Log10 作為 YScaling Option下拉菜單中選擇 Highest,Lowest 或 Unscaled。Error Type下拉菜單