分光光度計(jì)測(cè)還原糖含量

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱(chēng):班級(jí):實(shí)驗(yàn)人:實(shí)驗(yàn)時(shí)間:實(shí)驗(yàn)人:研究背景與目的：掌握還原糖含量測(cè)定的方法之一的3,5二硝基水楊酸比色法，熟悉722分 光光度計(jì)的主要用途、工作原理及使用流程。實(shí)驗(yàn)原理：已知在植物體內(nèi)含有一定量的還原糖，利用還原糖的還原性，使其與3,5.二硝基 水楊酸反應(yīng)，生成有吸光性的3-氨基-5硝基水楊酸。在某濃度范I制內(nèi)，該物質(zhì)在540imi F 的光吸收與還原糖含量成正比，通過(guò)測(cè)定該物質(zhì)的消光值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可得樣品中還 原糖含量。儀器與試劑：722光柵分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)：雙列八孔 標(biāo)號(hào)：09035天津市中壞實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）電磁爐 架盤(pán)天平

2、 具塞刻度試管 移液器 容屋瓶燒杯研缽漏斗151111*9lOOullOOOul100nil*92mg/nil葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液10mg/nil 3,5二硝基水楊酸溶液蒸館水實(shí)驗(yàn)步驟：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7只15ml具塞刻度試管，編號(hào)，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 亳升，然后用移液器向各試管加蒸館!水，使最后體積為1.0亳升，搖勻，再各加入3,5二硝 基水楊酸溶液1亳升，搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5分鐘，取出冷卻至室溫，用蒸館I水稀釋 至15毫升混勻，用分光光度計(jì)在540mn卜測(cè)定消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為 橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。植物樣品中還原糖的提取

3、將植物樣品一蘋(píng)果稱(chēng)取lg放入研缽中，加入少量石英砂，磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到100亳升容量 瓶中，用蒸館水少量多次地清洗研缽，再將洗液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，至70-801111,搖勻，置于 80度恒溫水浴中浸提半小時(shí)，其間搖勻數(shù)次，是還原糖浸出。還原糖含量的測(cè)定待上述提取液冷卻到室溫，過(guò)濾，濾液達(dá)十幾亳升即可，取濾液1亳升放入15ml具塞刻度 試管中，加入1亳升3,5-二硝基水楊酸溶液，搖勻后在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5分鐘，取出冷卻 后稲釋到15亳升。使用722分光光度計(jì)測(cè)定OD540值。（作兩個(gè)重復(fù)組取平均值）。數(shù)據(jù)整理與計(jì)算：標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度mg/ml編號(hào)123456789濃度mg/ml0. 00000. 013

4、30. 04000. 06670. 09330. 12000. 13330. 05310. 0525吸光度0. 0000. 0630. 2540. 4560. 6580. 8390. 9410. 3540. 350從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出樣品的OD540值對(duì)應(yīng)的還原糖量A (mg/ml),然后按下列公式計(jì)算樣品 中還原糖含量。還原糖含量()=【A*樣品橋釋總體積(ml) / (樣品重*1000) *100%將數(shù)據(jù)代入公式，得還原糖含量=(0.0531*15*100/(1*1000) *100%=7.96%還原糖含量=0.0525*15*100/(1*1000) *100%=7.88%平均值=(7.96

5、%+7.88%) =7.92%結(jié)果分析：所得兩組數(shù)據(jù)的吸光度值不相同，以至于所得濃度也不相同，其中可能存在的原因是使用具 塞刻度試管棉釋時(shí)存在終點(diǎn)標(biāo)定誤差。然而兩組數(shù)據(jù)取平均值，使誤差減小在允許范鬧內(nèi)。 思考題：比色測(cè)定法的原理及特點(diǎn)是什么？原理：光吸收定律即朗伯-比爾定律，由于物質(zhì)對(duì)光有選擇吸收的作用且在一定濃度范I韋I內(nèi)， 物質(zhì)在某波長(zhǎng)卜的光吸收與其濃度成正比，所以利用標(biāo)準(zhǔn)溶液求得標(biāo)準(zhǔn)光吸收曲線，再根據(jù) 所得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中尋找相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)即町知道未知溶液的濃度。光吸收簡(jiǎn)便，快速, 靈敏度高，準(zhǔn)確度較高，應(yīng)用廣泛。比色測(cè)定法中為什么要設(shè)空白，設(shè)空白時(shí)要注意什么？消除溶液中其他因素的影響，

6、設(shè)置空白時(shí)要注意只有葡萄糖濃度一個(gè)自變量變化，保證其他 量均相同。試分析一下樣品的稀釋倍數(shù)是如何確定的以及對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)原理中講到，在一定濃度范鬧內(nèi)，吸光度與還原糖含量呈正比，由由于吸光度要控制在 0.2至0.8之間，所以所需濃度便可知，即可通過(guò)桶釋溶液實(shí)現(xiàn)。如呆不在范I判內(nèi)，則超出 呈正比的范圍，所得濃度就會(huì)不準(zhǔn)確。為什么還原糖與3,5二硝基水楊酸溶液要先反應(yīng)后稀釋?zhuān)恳驗(yàn)闃蜥屒斑€原糖濃度較高，并且3,5.二硝基水楊酸溶液過(guò)量，這樣可以使得還原糖充分反 應(yīng)，如果先稀釋則還原糖濃度較低，反應(yīng)時(shí)間加長(zhǎng)，速率較慢。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，你認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有什么不合理之處？實(shí)驗(yàn)中，容量瓶的使用。參考文獻(xiàn)

7、：揭念芹基礎(chǔ)化學(xué)2000年9月第一版2008年7月第八次印刷孫英分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)2009年3月第一版袁靜明趙強(qiáng)3,5二硝基水楊酸法測(cè)定葡萄糖方法的改進(jìn)（山西大學(xué)學(xué) 報(bào)（自然科學(xué)版）1986年01期722分光光度計(jì)的使用說(shuō)明 HYPERLINK http:/weiikii.baiclu.coin/view/92586cl37ee06efif5aefB079b.htnil http:/weiikii.baiclu.coin/view/92586cl37ee06efif5aefB079b.htnil實(shí)驗(yàn)小結(jié)：這是第一次的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，與同伴的配合中仍然存在著默契程度不足的問(wèn)題，相信在口后 的實(shí)驗(yàn)中會(huì)有所改進(jìn)，其次，由于