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文檔簡介

1、Q/LB.XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T 1.12020標準化工作導(dǎo)則 第1部分:標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本部分由長春海關(guān)提出并歸口。 本部分起草單位: 長春海關(guān)。 本部分主要起草人: 馬文晨、孟慶峰、王準、王瑋琳、劉金華、孟日增、王偉利。華支睪吸蟲卵檢測方法范圍本標準規(guī)定了人糞便中華支睪吸蟲卵檢測方法的原理、試驗條件、試劑與材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗步驟和試驗數(shù)據(jù)處理及試驗報告。 本標準適用于人糞便中華支睪吸蟲卵核酸檢測。 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的

2、引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。實時熒光PCR real-time PCR在 PCR 擴增時加入帶有熒光基團的特異性探針(Taqman 探針) 或熒光染料, 使 PCR 產(chǎn)物的積累與熒光信號的積累完全同步, 實現(xiàn) PCR 產(chǎn)物的實時監(jiān)測。Ct 值 cyclethresholdvalue每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)??s略語bp: 堿基對(base pair)CTAB: 十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammonium bromide)DNA: 脫氧核

3、糖核酸(deoxyribonucleic acid)dNTP: 脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)OD: 光密度值(optical density)PCR: 聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chainreaction)Taq 酶: 從水生熱棲菌中分離出的具有熱穩(wěn)定性的 DNA 聚合酶(thermus aquaticu)TE:Tris-HCl、EDTA 緩沖液Tris: 三(羥甲基) 氨

4、基甲烷tris (hydroxymethyl) aminomethane試劑和材料除另有規(guī)定外, 試劑為分析純或生化試劑。 試驗用水應(yīng)符合 GB/T 6682 中一級水的規(guī)定。 所有試劑均用無 DNA 酶污染的容器分裝。液氮0.5 mol/L EDTA 緩沖液(pH 8.0)。CTAB 提取緩沖液 (2.0% ): 20 g/L CTAB, 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0 ), 1.4 mol/L NaCl,0.02 mol/L EDTA(pH 8.0)。CTAB 沉淀液(0.5% ):5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL

5、)。NaCl 溶液(1.2 mol/L)。三氯甲烷。三氯甲烷 / 異戊醇(24 :1,V/V)。異丙醇。70% 乙醇。TE 緩沖液:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA 緩沖液(pH 8.0)。10PCR緩沖液:100 mmol/L KCl,160 mmol/L (NH4)2SO4, 20mmol/L MgSO4,200 mmol/L Tris-HCl (pH8.8),1% Triton X-100,1 mg/ml BSA。如果具有等效的商品化試劑盒, 則可使用這些等效產(chǎn)品。熒光 PCR 反應(yīng)混合液:10 L 反應(yīng)體系包括:1 U 2 U(unit,

6、 酶學(xué)單位) 的 Taq 酶、1PCR緩沖液、2.5 mmol/L 4.0 mmol/L 的 Mg2+ 、0.2 mmol/L 的 d (A, C, G) TPs、0.2 mmol/L 0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/L ROX 染料 ( 某些熒光 PCR 儀不需要 ROX 校正 )。如果具有等效的商品化試劑盒, 則可使用這些等效產(chǎn)品。普通PCR引物華支睪吸蟲的 PCR 檢測所用的引物序列見表1 。普通PCR引物序列名稱序列目的基因名稱5端引物5-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3細胞色素c氧化酶亞基1 ( cox1 )基因3端引物5-ACTATCCCAGTAAC

7、CCCGCC-3實時熒光 PCR引物與探針: 華支睪吸蟲的實時熒光 PCR 檢測所用的引物和探針序列見表2 實時熒光 PCR引物序列名稱序列目的基因名稱5端引物5-TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3細胞色素c氧化酶亞基1 ( cox1 )基因3端引物5-AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3探針5-FAM-AGCTCATCATATGTTTACTG-MGB-3儀器和設(shè)備實時熒光 PCR 儀。離心機:離心力不小于 12 000 g。離心管(1.5 mL,2.0 mL)。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。微量移液器:2.5 L、20 L、100 L、200 L、1 000 L

8、。研缽或冷凍粉碎裝置。恒溫水浴鍋或干式恒溫器。天平:感量 0.01 g。檢驗步驟用液氮充分研磨至糜狀;或采用合適的冷凍粉碎均質(zhì)裝置對樣品進行充分地研磨至糜狀。稱取研磨后的樣品 200 mg 于 2.0 mL 離心管中,加入 1.5 mL 2.0% CTAB 提取緩沖液和 10 L 蛋白酶 K 溶液,65 30 min, 期間每隔10min振蕩混勻;12 000 g 離心 10 min,轉(zhuǎn)移上清于潔凈的離心管中。加 750 L 三氯甲烷 / 異戊醇,混勻,12 000 g 離心 5 min,轉(zhuǎn)移上清液于潔凈的離心管中加 2 倍體積 CTAB 沉淀液,室溫靜止 60 min,12 000 g 離心

9、 15 min,棄上清。加入350 L NaCl溶液將沉淀重懸浮。再加入 350 L 三氯甲烷,旋渦振蕩進行混勻,12 000 g 離心 10 min。轉(zhuǎn)移上清后加入 0.6 倍體積的異丙醇用來沉淀核酸,室溫放置 20 min,12 000 g 離心 10 min,棄上清。加入 500 L 70% 乙醇洗滌一次,晾干。加入 100 L TE,溶解沉淀。立即使用或 20保存?zhèn)溆谩R部梢杂玫刃У?DNA 提取方法提取 DNA 模版??墒褂玫刃У纳唐坊?DNA 提取試劑盒,按操作說明書進行操作。DNA 的濃度和純度測定樣品 DNA 使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測定260 nm 和280 nm

10、處的吸光值 A260 和A280。 DNA 的濃度按式(1) 進行計算:c=AN50( AUTONUM )式中:c DNA 濃度, 單位為納克每微升(ng/L);A 260 nm 處的吸光值;N 核酸稀釋倍數(shù)。當 DNA 濃度高于10 ng/L,A260/A280 比值在1.4 2.5 之間時,DNA 模板適宜于 PCR 擴增。PCR 檢測普通PCR檢測PCR反應(yīng)按表3配置25 L反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)體系成分用量(L)10PCR buffer(Mg 2+)12.5上游引物(25 pmol/L )1.0下游引物(25 pmol/L )1.0 Ex Taq DNA (5 U/L )1.0 DNA模

11、板5.0ddH2O水5.5擴增程序及反應(yīng)條件將PCR反應(yīng)管置于PCR擴增儀,反應(yīng)參數(shù)設(shè)置:第一階段,94 預(yù)變性2 min。第二階段,94 變性30 s、60 退火30 s、72 延伸30s,共30個循環(huán)。第三階段,72 延伸5 min,最后4保存。PCR產(chǎn)物的電泳檢測用TAE電泳緩沖液配制成1%瓊脂糖平板(溴化乙錠終濃度0.5 g/mL)。將平板放入水平電泳槽中,加入1TAE電泳緩沖液剛剛高出凝膠表面,將PCR擴增產(chǎn)物6 L與6 L上樣緩沖液混合,分別加入樣品孔中,取5 L DNA Marker 100 bp加入到標準分子量對照孔內(nèi)。5 V/cm恒壓電泳30 min45 min。結(jié)果判定用凝

12、膠成像系統(tǒng)進行分析。陽性樣品擴增一條大小為231 bp的特異性條帶,陰性對照和空白對照應(yīng)無該特異性條帶;在陰性和陽性對照成立情況下,如被檢樣品無條帶,則結(jié)果為陰性,如被檢樣品有條帶,大小為231 bp,即判定為華支睪吸蟲卵核酸陽性。必要時取PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定,進一步確認待測樣品的結(jié)果。如果出現(xiàn)與設(shè)計長度不同的條帶,為非特異性反應(yīng),需重復(fù)試驗,兩次試驗都為非特異性反應(yīng)時,可判為陰性。實時熒光PCR檢測熒光PCR反應(yīng)體系按表4配置25 L反應(yīng)體系:熒光PCR反應(yīng)體系成分用量(L)2 熒光定量 PCR 預(yù)混液12.5 上游引物(10 mol/L)1.0下游引物(10 mol/L)1.0 探針(10 mol/L)1.0DNA模板5.0ddH2O水4.5熒光PCR反應(yīng)參數(shù)在檢測區(qū)進行。將9.2.1中加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi),記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置:第一階段,95 30s。第二階段,95 5 s、60 30 s(在此收集熒光),40個循環(huán)。如試劑不同需要進行適當調(diào)整。結(jié)果判定9.3.1結(jié)果分析條件設(shè)定讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點,不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整。9.3.2質(zhì)控標準陰性對照和空白對照無Ct值并且無擴增曲線。陽性對照樣品有對數(shù)擴增曲線,

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