2020生物樣品定量分析方法驗證指導原則

1、2020生物樣品定量分析方法驗證指導原則、范圍準確測立生物基質（）這些數(shù)據(jù)可被用于支持藥品的安全性和有效性，或根據(jù)毒動學.藥動學和生物等效性試 驗的結果做0生物樣品左量分析方法驗證和試驗樣品分析應符合本指導原則的技術要求。應該在相應的 生物GLP GCP （一）分析方法的完整驗證分析方法驗證的主要目的是，證明特泄方法對于測怎在某種生物基質中分析物濃度的可靠性此外，方法驗證應采用與試驗樣品相同的抗凝劑。一般應對每個新分析方法和新分析物進行完整驗證。當難于獲得相同的基質時，可以采用適當基質替代，但要說明理由。一個生物分析方法的主要特征包括：選擇性、立量下限、響應函數(shù)和校正范用（標準曲線 性能人準確

2、度、精密度、基質效應、分析物在生物基質以及溶液中儲存和處理全過程中的穩(wěn)左 件對照標準物質通常使用適當?shù)膬葮恕？?，例如顯示該物質本身或其相關的任何雜質不產(chǎn)生干擾。足夠高的同位素純度，并且不發(fā)生同位素交換反應，以避免結果的偏差。1.選擇性6 個受試者的適宜的空白基質來證明選擇性（動物空白基質可以不同批次混合），20%,5%時，通常即可以接受。應該考察藥物代謝物、經(jīng)樣品預處理生成的分解產(chǎn)物以及可能的同服藥物引起 F擾的程度。在適當情況下，也應該評價代謝物在分析過程中回復轉化為母體分析物的可能性2 殘 留20%,5%空白樣品，然后分析下一個試驗樣品。定量下限量下限是標準曲線的最低點，應適用于預期的濃度

3、和試驗目的。標準曲線應該在指龍的濃度范國內評價儀器對分析物的響應.獲得標準曲線。通過加入已知濃度的 分析物（和內標）到空白基質中，制備各濃度的校正標樣其基質應該與目標試驗樣品基質相 同。方法驗證中研究的每種分析物和每一分析批，都應該有一條標準曲線。度范圉，由定量下限和泄量上限（校正標樣的最髙濃度）動學。應該使用至少 6 個校正濃度水平，不包括空白樣品（不含分析物和內標的處理過的基質樣 品） 和零濃度樣品（含內標的處理過的基質）。每個校正標樣可以被多次處理和分析。算標準曲線參數(shù)。3 條標準曲線。校正標樣回算的濃度一般應該在標示值的15%20%75校正6 存的校正標樣。準確度分析方法的準確度描述該

4、方法測得值與分析物標示濃度的接近程度，表示為：（測得值/真 實值）xlOO%.分比。應通過單一分析批（批內準確度）和不同分析批（批間準確度）度。為評價一個分析批中不同時間的任何趨勢，推薦以質控樣品分析批來證明準確度，其樣品 數(shù)不少于一個分析批預期的樣品數(shù)批內準確度5 3 75%準確度均值一般應在質控樣品標示值的15%20%范圍內。批間準確度3 5 個測左值來評價。準確度均值一般應在質控樣品標示值的15%范圍內，對于左 量下限，應在標示值的20%范圍內。報告的準確度和精密度的驗證數(shù)摒應該包括所有獲得的測立結果，但是已經(jīng)記錄明顯失誤 的情況除外。精密度（濃度質控樣品的精密度。4 5 個樣品。對于質

5、控樣品，批內變異系數(shù)一般不得超過15%,20%o3 個分析批（2 天）的立量下限以及低、中、高濃度， 每5 15%,立量下限的變異系數(shù)不得超過 20%o 7 稀釋可靠性用空白基質稀釋該樣品（5 個測定值），度應在15%之內，稀釋的可靠性應該覆蓋試臉樣品所用的稀釋倍數(shù)?？梢酝ㄟ^部分方法驗證來評價稀釋可靠性。如果能夠證明其他基質不影響精密度和準確度, 也可以接受其使用?；|效應6 6 批基質，但應該說明理由。對于每批基質應該通過計算基質存在下的峰面（由空白基質提取后加入分析物和內標測得與不含基質的相應峰而積（分析物和內標的純溶液）比值，計算每一分析物和內標的基質因子。進一步通過分析物的基質因子除以

6、內標的基質因子，計算經(jīng)內標歸一化的基質因子。從6 批基質il15%6 別加入髙濃度和低濃度（3 倍以內以及接近定量上限），15%o除正?；|外，還應關注其他樣品的基質效應，例如溶血的或高血脂的血漿樣品等。穩(wěn)定性夠的。（空白基質加入分析物至左量下限濃度3 倍以內以及接近立量上限15%范圍內。穩(wěn)左性檢查應考察不同儲存條件，時間尺度應不小于試驗樣品儲存的時間。通常應該進行下列穩(wěn)泄性考察匚分析物和內標的儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性。從冰箱儲存條件到室溫或樣品處理溫度，基質中分析物的冷凍和融化穩(wěn)圧性?；|中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性。此外，如果適用，也應該進行下列考察。處理過的樣品在室溫下或在試驗過程儲存

7、條件下的穩(wěn)左性。處理過的樣品在自動進樣器溫度下的穩(wěn)定性。在多個分析物試驗中，特別是對于生物等效性試驗，應該關注每個分析物在含所有分析物 基質中的穩(wěn)泄性。圧性。（二）部分驗證（三）交叉驗證15%67樣品測得的兩組數(shù)值差異應在兩者均值的士 20%范圍內。三. 試驗樣品分析在分析方法驗證后，可以進行試驗樣品或受試者樣品分析。需要在試驗樣品分析開始前證 實生物分析方法的效能。應根據(jù)已驗證的分析方法處理試驗樣品以及質控樣品和校正標樣，以保證分析批被接受。（-）分析批6 3 平質控樣品（5%,兩者中取數(shù)目更多者），分析的試驗樣品。所有樣品（校正標樣、質控和試驗樣品）的準確度和精密度。對于生物等效性試驗，建

8、議一名受試者的全部樣品在同一分析批中分析，以減少結果的變 異。（二） 分析批的接受標準應該使用下列接受標準。校正標樣測泄回算濃度一般應在標示值的15%20%6 個75%樣，重新計算不含該標樣的標準曲線，并進行回歸分析。質控樣品的準確度值應該在標示值的士 15%范圍內。至少 67%質控樣品，且每一濃度水平 至少50%樣品應符合這一標準。在不滿足這些標準的情況下，應該拒絕該分析批，相應的試驗 樣品應該重新提取和分析。在同時測立幾個分析物的情況下，對每個分析物都要有一條標準曲線。如果一個分析批對 于一提取和分析樣品，測定被拒絕的分析物。如果使用多重校正標樣，其中僅一個泄量下限或泄量上限標樣不合格，則

9、校正范用不變。15%,（三）校正范圍如果在試驗樣品分析開始前，已知或預期試驗樣品中的分析物濃度范用窄，則推薦縮窄標 準曲線范用，調整質控樣品濃度，或者適當加入質控樣品新的濃度，以充分反映試驗樣品的濃 度。如果看起來很多試驗樣品的分析物濃度髙于疋量上限，在可能的情況下，應該延伸標準曲 線的范闈，加入額外濃度的質控樣品或改變英濃度。2 析方法應被重新驗證（部分驗證），以確認響應函數(shù)并保證準確度和精密度。（四）試驗樣品的重新分析和報告值選擇應該在試驗汁劃或標準操作規(guī)程中預先確左重新分析試驗樣品的理由以及選擇報告值的標準在試驗報告中應該提供重新分析的樣品數(shù)目以及占樣品總數(shù)的比例。重新分析試驗樣品可能基

10、于下列理由。由于校正標樣或質控樣品的準確度或精密度不符合接受標準，導致一個分析批被拒絕。內標的響應與校正標樣和質控樣品的內標響應差異顯著。進樣不當或儀器功能異常。準曲線中被拒絕，導致比其他分析批的定量下限高。在給藥前樣品或安慰劑樣品中測得可肚量的分析物。色譜不佳。對于生物等效性試驗，通常不能接受由于藥動學理由重新分析試驗樣品。品的身份、初始值、重新分析的理由.重新分析獲得值、最終接受值以及接受理由。在儀器故障的情況下，如果已經(jīng)在方法驗證時證明了重新進樣的重現(xiàn)性和進樣器內穩(wěn)立性, 則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進樣匚但對于拒絕的分析批，則需要重新處理樣品。（五）色譜積分并在要求時提交。（六） 用于評

11、價方法重現(xiàn)性的試驗樣品再分析在方法驗證中使用校正標樣和質控樣品可能無法模擬實際試驗樣品。例如，蛋白結合.已 知和cmax 10%樣品，如果樣2000,5%樣品。67%值的20%I 羽內。至少在下列情形下，應該進行試驗樣品的再分析。毒動學試驗，每個物種一次。所有關鍵性的生物等效性試驗。首次用于人體的藥物試臉。首次用于患者的藥物試驗。首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗。對于動物試驗，可能僅需要在早期關鍵性試驗中進行實際樣品的再分析，例如涉及給藥劑 量和測得濃度關系的試驗。四. 配體結合分析配體結合分析主要用于大分子藥物。前述的驗證原則以及對試驗樣品分析的考慮一般也適用但是由于大分子固有的特點和結

12、構復雜性，使其難以被提取，所以常常在無預先分離的情況下測左分析物。此外.方法的檢測終點并不直接來自分析物的響應，而來自與其他結合試劑產(chǎn)生的間接信號配體結合分析中每個校正標樣質控樣品以及待測樣品一般都采用復孔分析如無特殊說明， 本節(jié)以雙孔分析為原則。（-）方法驗證前的考量標準品選擇保方法性能不變?；|選擇代基質建立分析方法。但應對使用替代基質建立方法的必要性加以證明。明基質效應的消除。最低需求稀釋度的確定分析方法建立與驗證過程中，可能需要對基質進行必要的稀釋，以降低其產(chǎn)生的高背景信號在此情況下，應考察最低需求稀釋度。它是指分析方法中為提髙信噪比、減少基質下擾、優(yōu)化準確度與精密度而必須使用緩沖液對

13、生物樣品進行稀釋的最小倍數(shù)。應使用與試驗樣品相同的基質來配制加藥樣品來確定最低需求稀釋度。試劑因此改變，從而確保不同批次結果的一致性。件進行記錄，以確保方法性能長期不變。（二）方法驗證完整驗證S 形曲線。6 等距離分布。除校正標樣外，可使用錨定點輔助曲線擬合。6 75%的校正標樣回算濃度在標示值的20% （泄量下限與左量上限在25%）范用 內。左量下限與上量上限之間的濃度范用為標準曲線的左量范弗 1受標準。80%20%范（范囤內10 80%以上的樣品準確度在20%（25%范圍內）要，可能需要針對病人群體基質或特殊基質（）考察選擇性。5 （3倍以內）、中濃度質控（標準曲線中段）、髙濃度質控（75

14、%以上）6 3 套質控樣品（5 個濃度的質控樣品）20%（25%20（25%）o （即相對偏差絕對值與變異系數(shù)之和）30（泄量下限和左量上限為 40）o法的稀釋線性考察，即評價樣品濃度超過分析方法的肚量上限時，用空白基質將樣品濃度稀 釋至左效應，即髙濃度分析物引起的信號抑制。稀釋線性考察中，稀釋至圧量范圍內的每個 QC 樣品經(jīng)稀釋度校正后的回算濃度應在標示 值的20%范圉內，且所有 QC 樣品回算終濃度的精密度不超過 20%。（好釆用超出泄量上限的樣品），3 30%,如果存在樣品稀釋非線性的情況（即非平行性），性考察。67%值的20%a要求對其進行驗證。部分驗證和交叉驗證在二、（二）和二、（三

15、）中敘述的關于驗證的各項內容都適用于配體結合分析。（三）試驗樣品分析分析批一載體上設置質控樣品。所有樣品均應復孔測定。試驗樣品分析的接受標準75%以上的校正標樣（6 個）示值的20（左雖下限和左量上限為25%）范用內。2 3 水平（低、中、髙濃度）67%20% 范陽20%50%實際樣品再分析在3.6 節(jié)中關于實際樣品再分析的所有論述均適用于配體結合分析。再分析樣品的接受標 準為初測濃度與復測濃度都在二者均值的30%范用內，再分析樣品中至少以上應符合該接受標準五、試驗報告（-）方法驗證報告如果方法驗證報告提供了足夠詳細的信息，則可以引用主要分析步驟的標準操作規(guī)程標題, 否則應該在報告后而附上這些

16、標準操作規(guī)程的內容 O應該記錄任何對驗證計劃的偏離。方法驗證報告應該包括至少下列信息。驗證結果概要。所用分析方法的細節(jié)，如果參考了已有方法，給出分析方法的來源。摘要敘述分析步驟（分析物，內標，樣品預處理、提取和分析）。對照標準品（來源，批號，分析證書，穩(wěn)崔性和儲存條件九校正標樣和質控樣品（基質，抗凝劑，預處理.制備日期和儲存條件）。分析批的接受標準。分析批所有分析批列表，包括校正范圍.響應函數(shù)、回算濃度、準確度：所有接受分析批的質控樣品結果列表：儲備液、工作溶液、質控在所用儲存條件下的穩(wěn)泄性數(shù)據(jù)：選擇性、 立量下限、殘留、基質效應和稀釋考察數(shù)據(jù)匚方法驗證中得到的意外結果，充分說明采取措施的理由。對方法或對標準操作規(guī)程的偏離。所有測泄及每個訃算濃度都必須出現(xiàn)在驗證報告中。（二）樣品分析報告全部源數(shù)據(jù)應該以其原始格式保存，并根據(jù)要求