南通大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)譯文01109082024陳飛

1、英文題目 Ameliorative Effects of 5-Hydroxymethyl-2-furfural(5-HMF) from Schisandra chinensis on Alcoholic LiverOxidative Injury in Mice中文題目五味子中的5-羥甲基糠醛（5-HMF）對(duì)酒精性肝損中文題目傷小鼠的改善作用作 者：陳飛專業(yè)：生物工程譯文：五味子中的5-羥甲基糠醛（5-HMF）對(duì)酒精性肝損傷小鼠的改善作用摘要：本文的目的是探討5-羥甲基糠醛（5-HMF）對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作 用，5-HMF，是一種從五味子果實(shí)中分離出來用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物

2、，實(shí)驗(yàn) 小鼠分別與不同濃度的 5-羥甲基糠醛預(yù)處理（7.5,15，和 30毫克/千克）進(jìn)行灌胃喂養(yǎng) 七天。檢查了血清以及肝組織的生化標(biāo)記和酶抗氧化劑，我們的結(jié)果表明肝組織中的ALT 活性（谷氨轉(zhuǎn)氨酶），AST （谷草轉(zhuǎn)氨酶），TC （總膽固醇），TG （甘油三脂），L-dlc （低密 度脂蛋白）和血清中的MDA （丙二醇）指標(biāo)，用5-hmf的組與酒精組相比顯著降低（pV 0.05）。相反，酶抗氧化劑CAT （過氧化氫酶），谷胱甘肽過氧化物酶（谷胱甘肽過氧化物 酶），SOD （超氧化物歧化酶）等指標(biāo)在5-HMF組中明顯升高（PV0.05）。此外，炎癥反應(yīng) 標(biāo)記腫瘤壞死肝水平因子-a （TNF-a

3、 ）和白細(xì)胞介素T（IL-10 p ）顯著抑制（PV0.05）。 組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5-羥甲基糠醛（30毫克/公斤）預(yù)處理的明顯防止酒精引起的肝細(xì)胞 凋亡和脂肪變性。這表明5-HMF對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用可能是由于其強(qiáng)大的抗氧化性 能力。關(guān)鍵詞： 5-羥甲基糠醛；五味子；酒精性肝損傷；氧化應(yīng)激導(dǎo)言越來越多的證據(jù)表明，長期酒精濫用和酒精依賴導(dǎo)致許多疾病，如營養(yǎng)不良和酒精性 肝?。ˋLD）。一般來說，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化作用在酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制中起重要作 用。由于氧化應(yīng)激參與ALD的發(fā)應(yīng)，使用抗氧化劑可能會(huì)削弱乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和預(yù)防 機(jī)制。因此，抗氧化劑最主要的來源和它們?cè)诜乐挂掖家鸬母螕p

4、傷起的作用是一個(gè)重要 的研究目的。5-HMF是一個(gè)著名的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，主要用酸催化脫水果糖產(chǎn)生的一系列產(chǎn)物。有 趣的是，它也發(fā)現(xiàn)在大量的熱加工的中藥中，如枸杞,山茱萸,生地黃,何首烏以及五味子。 最近幾十年，有許多關(guān)于 5-HMF 致突變，有毒性的討論。因此，蜂蜜啤酒和咖啡中的 5- 羥甲基糠醛含量一直嚴(yán)格的控制。盡管以前對(duì)5-HMF的危險(xiǎn)性有很多關(guān)注，但近些年來有 關(guān)5-HMF有生物活性的理論逐漸被接受。據(jù)報(bào)道，5-HMF具有良好生物學(xué)效應(yīng)，如抗氧化 活性，抗缺氧，和鐮狀紅抑制血細(xì)胞。我們知道，缺氧性損傷的機(jī)制包括氧化應(yīng)激過程，5-HMF能保護(hù)肝細(xì)胞系以免在體外 H2O2 誘導(dǎo)損傷。因此，

5、它對(duì)體內(nèi)可能引起肝損傷的分子機(jī)制十分敏感。在這里，此次研 究的目標(biāo)是進(jìn)一步探討5-HMF可能對(duì)急性肝損傷和酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果和討論從五味子分離和分析5-羥甲基糠醛 夏臘梅果實(shí)被用于肝損害的中藥已經(jīng)好幾個(gè)世紀(jì)了，除了木脂素，來自熱處理過的 5-HMF具有保肝和抗氧化作用，這時(shí)對(duì)五味子的5-HMF進(jìn)行高效液相色譜法。結(jié)果表明， 樣品中的5-HMF的含量處于2.50.2毫克/克。HMF對(duì)體重和臟器指數(shù)的影響體重是健康的一個(gè)重要指標(biāo)，在本研究中，酒精組的小鼠體重和5-HMF組相比沒有發(fā) 生變化。計(jì)算出小鼠的肝和脾的臟器系數(shù)，與先前的研究相比，酒精組P0.05）小鼠的 肝脾的臟器指數(shù)與對(duì)照

6、組相比顯著增加,不過與5-HMF組相比降低了 15和30毫克/公斤。羥甲基糠醛對(duì)血清生化指標(biāo)的影響血液中AST和ALT的泄漏間接反映了乙醇引起的肝衰竭和肝中毒,正如表2中顯示的 那樣，酒精注射12小時(shí)后血清中ALT，AST水平顯著升高（p0.05），這說明肝細(xì)胞已經(jīng) 損傷，酒精性肝損傷模型已經(jīng)成功建立。然而，經(jīng)5-HMF處理七天后的血清生化指標(biāo)與酒 精處理過的相比顯著降低。值得注意的是，用不同劑量5-HMF處理酒精組可使其肝功能逐 漸恢復(fù)。越來越多的證據(jù)表明，脂肪變性的特點(diǎn)是TG的積累。這是消耗乙醇的一個(gè)重要反應(yīng)， 與控制相比，酒精組中的TG, TC, L-DLC的水平顯著升高。然而在5-HM

7、F組中它們的水平 降低和倒轉(zhuǎn)到可控制的水平。有趣的是，治療組對(duì)酒精誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的作用有明顯的 劑量依賴性。羥甲基糠醛對(duì)肝生化活性的影響 氧化應(yīng)激是一種對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制。為了消除氧化壓力，許多酶和非酶的機(jī)制. 這些抗氧化酶包括 CAT， GSH-Px， SOD。如圖，與對(duì)照組相比，肝抗CAT，GSH-Px和SOD活性在酒精組分別降低43.2%, 52.7%， 和18.8%。然而，用5-HMF完全預(yù)處理七天可以防止降低。MDA是一種分解產(chǎn)物，已被用 來作為生物標(biāo)志物用于檢測(cè)肝臟脂質(zhì)過氧化的影響。相反的是，與正常組相比，在酒精組 中MDA含量升高57.01%。然而，經(jīng)5-HMF處理的小鼠M

8、DA濃度明顯升高。2.5。5-羥甲基糠醛對(duì)肝臟炎癥標(biāo)志物的影響TNF-a and IL-10激活，兩個(gè)主要的炎癥介質(zhì)參與炎癥，在酒精性肝損傷中起著至 關(guān)重要的作用。TNF-a和IL-10 a可引起肝細(xì)胞損傷和死亡。為了探討乙醇對(duì)炎性反應(yīng)的影響，對(duì)TNF-a和IL1B在肝組織的表達(dá)的部分是由酶 聯(lián)免疫吸附法測(cè)定與確定。如圖4所示，結(jié)果顯示，酒精注射后肝臟中的TNF-a和IL 1B有相當(dāng)大的增長，分別為43.1%和61.4%。與5-HMF可以防止TNF-a誘導(dǎo)的單核細(xì)胞 粘附這一結(jié)果一致，經(jīng)5-HMF減毒處理后的組與酒精組相比TNF-a和IL1B有很強(qiáng)的活 性。2.6。病理觀察下圖顯示不同治療組中

9、所獲得的肝臟具有代表性的肝臟顯微照片。正常組的肝小葉清晰， 結(jié)構(gòu)規(guī)則并有中央靜脈線，細(xì)胞核正常無水腫，脂肪變性和可見病變。然而，在酒精組中， 典型的病理特征包括壞死，炎性浸潤和廣泛的空泡變性，這證實(shí)了酒精性肝損傷模型的成 功建立。用陽性藥物處理（護(hù)肝片）和5-HMF處理，結(jié)果顯示5-HMF可以對(duì)酒精引起的和 損害起到一定的保護(hù)作用，而用護(hù)肝片處理的僅表現(xiàn)為輕微的肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤。 酒精處理前用高劑量的5-HMF治療（30毫克/千克）可明顯減輕細(xì)胞凋亡和炎癥，幾乎接 近于正常組。從結(jié)果，我們推測(cè)5-HMF預(yù)處理可以減輕乙醇誘導(dǎo)的肝損傷。2.7。肝臟病理學(xué)分類和分級(jí) 從分級(jí)和分期系統(tǒng)來看，壞

10、死性炎癥不僅可以衡量壞死程度而且可以推測(cè)可能的疾病反應(yīng)和參數(shù)。如表 3 所示，肝臟病理變化主要是由肝細(xì)胞脂肪變性所致，主要發(fā)生在中央 靜脈。相對(duì)于正常組，酒精組表現(xiàn)出明顯的肝損傷。對(duì)照組和經(jīng)5-HMF處理的組脂肪變性 狀態(tài)有不同程度的減輕。Huganpin是一種肝保護(hù)劑，用于預(yù)防和治療肝損傷。在實(shí)驗(yàn)中, 350 mg/kg的劑量是指日常用量。作為一種積極藥物，Huganpin顯著影響酒精誘導(dǎo)肝損傷 的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)部分3.1?；瘜W(xué)品和試劑夏蠟梅果實(shí)是在通化市收集，并由中國農(nóng)科院特殊野生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和植物研究所的王英 平教授檢驗(yàn)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），甘油三酯（TG），總

11、膽固醇 （TC），低密度脂蛋白膽固醇（l-dlc），過氧化氫酶（CAT），丙二醛（MDA），超氧化物歧 化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的商業(yè)試劑盒從南京建成生物工程研究所購 買。護(hù)肝片（批號(hào)091103），肝保護(hù)劑，主要含柴胡，板藍(lán)根、五味子是從浙江醫(yī)藥有限 公司采購。腫瘤壞死因子-a （TNF -a ）和白介素1receptor （IL-10 ）是只&。系統(tǒng)采購。 HPLC級(jí)甲醇是從美國的Fisher化工廠采購。其他化工用品，比如酒精都是從中國北京的 化工廠采購。3.2。5-羥甲基糠醛的提取，分離和分析將200克干燥的五味子粉末放入容量瓶中并加入5升酒精， 40度超聲水浴

12、30分鐘三 次。 提取后，在 45 度下將過濾的溶液濃縮干燥。提取的物質(zhì)裝上硅膠柱。以上部分在（10% 的甲醇）半制備的流動(dòng)相中分離純化然后加入202毫克的5-HMF。在UV,NMR,EMI-MS的基 礎(chǔ)上通過光譜和元素分析的標(biāo)準(zhǔn)中比較HPLC的保留時(shí)間和以往報(bào)告的數(shù)據(jù)對(duì)5-HMF的結(jié) 構(gòu)加以闡明。采用紫外檢測(cè)器，島津分析中心系統(tǒng)的高效液相色譜分析測(cè)定五味子中的 5-HMF。HPLC方法采用Hypersil bds2柱（250*4.6毫米，5微米）。柱溫為30 C,檢測(cè)波長為 280 nm。流動(dòng)相為1毫升/分鐘的10%甲醇。20p L樣品溶液的流量直接注入色譜柱。高效液相色譜 如圖2所示。3.

13、3 動(dòng)物四十八只4周齡的ICR小鼠，體重為20 - 22 g,用于酒精性損傷的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由吉林大學(xué)提供，質(zhì)量證書號(hào)為SCXK （JI） 2011-0004 （長春，中國）。飼養(yǎng)在擁有25 土 2C ， 12 小時(shí)黑暗/光照周期的空調(diào)房間內(nèi)。所有對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及保養(yǎng)均按照中國 的法律。3.4。實(shí)驗(yàn)組和治療動(dòng)物隨機(jī)分為六組（每組 8 只），正常對(duì)照組，乙醇對(duì)照組，陽性對(duì)照組以及三組實(shí) 驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組用5-HMF灌胃處理，連續(xù)七天的劑量分別為7.5,15,30毫克/公斤每天。除 了陽性對(duì)照，正常組和酒精組只有0.9%的生理鹽水。第七天,正常對(duì)照組給予同等體積的 水，其他小鼠用50%的乙醇（4.

14、8克/公斤）進(jìn)行最后一次灌胃。然后所有的小鼠禁食12小時(shí)。采集血標(biāo)本及球后在室溫下保存45分鐘，一小時(shí)后分 離血清并離心（1500轉(zhuǎn)，10分鐘，4C）保存在-20C進(jìn)行生化分析。另外，實(shí)驗(yàn)前后，分別稱取動(dòng)物體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠用脊椎脫位的方法處死。 快速解剖取出肝臟和脾臟，用生理鹽水沖洗兩次，然后用濾紙擦干，測(cè)定濕重。與此同時(shí)， 記錄尺寸，外觀和切割面的紋理。從每只小鼠肝左葉取一小塊組織固定于10%的福爾馬林 溶液中進(jìn)行病理學(xué)分析。剩余肝組織存儲(chǔ)在-80C環(huán)境下進(jìn)行肝勻漿制備。3.5。血清生化標(biāo)志物的檢測(cè)。使用南京建成生物工程研究所（中國南京）的試劑盒測(cè)定血清中的AST,ALT,TC,L

15、-DLC 和 TG 等指標(biāo)。3.6。肝臟的抗氧化活性和氧化應(yīng)激標(biāo)記物檢測(cè)為了測(cè)定抗氧化活性，將肝組織混勻在50mM的磷酸鹽緩沖液中（ph7.4）。產(chǎn)生的緩 沖液在4C下離心15分鐘，上清液用于測(cè)定。肝勻漿中的CAT，GSH-Px和SOD水平是根 據(jù)試劑盒的說明測(cè)定（南京建成生物工程研究所）。 CAT 活性用過氧化氫的方法測(cè)定，其 次是用克萊本的方法測(cè)定。GSH-Px活性根據(jù)莫漢等人的方法測(cè)定。SOD活性采用波尚等人 的方法測(cè)定。丙二醛（MDA）通過測(cè)定形成的硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)。這些物質(zhì)是由德雷 珀和哈德利所描述的。用 Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。3.7。炎癥標(biāo)記物活性測(cè)定無血清培養(yǎng)

16、基中TNF-a和IL1B的水平由制造商確定（明尼阿波利斯，MN, USA）。 總的來說，將制備的試劑，樣品用酶標(biāo)記后在37C下反應(yīng)60分鐘。加入終止液后，十分 鐘內(nèi)測(cè)定好OD值。3.8。組織病理學(xué)檢查將肝組織（每組數(shù)量為 8）固定在 10%中性福爾馬林緩沖液（福爾馬林：磷酸鹽緩沖 液（0.01 M，pH 7.4） = 1:1） 24小時(shí)以上，用常規(guī)石蠟包埋，在切片5p m厚處標(biāo)記。 經(jīng)蘇木精-伊紅（H&E）染色，切片組織病理學(xué)變化用尼康TE 2000熒光顯微鏡觀察（尼 康，東京，日本）。這呈現(xiàn)了有代表性的圖像。組織病理學(xué)特征為肝臟的組織學(xué)變化的評(píng) 估，包括肝細(xì)胞變性或壞死，脂肪變性，炎癥細(xì)胞浸

17、潤，充血提供了依據(jù)。3.9。統(tǒng)計(jì)分析所有的實(shí)驗(yàn)都獨(dú)立的進(jìn)行了三次。通過單向方差分析（ANOVA ）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其 次是最小顯著差異（LSD）,采用SPSS 16軟件包進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)（SPSS公司，芝加哥， IL, USA）。病理資料采用Ridit分析分析；PV0.05或PV0.01被認(rèn)為是顯著的。4。結(jié)論在這項(xiàng)研究中，清楚的顯示，5-HMF可以保護(hù)由酒精引起的肝損害。并證明了可以恢 復(fù)CAT, GSH-Px和SOD，以及降低血清和肝臟脂質(zhì)過氧化，降低TNF-a和IL-10水平。 此外，5-HMF也可以緩解脂質(zhì)降解和肝細(xì)胞凋亡。總的來說，這為5-HMF對(duì)于肝損傷的預(yù) 防和治療是有益的提供了

18、大量的證據(jù)。H0HOOH0HH0H0H00H0H0H0.O0H0、圖 1 ：果糖中 5-HMF 的生成途徑H0HOOH0HH0H0H00H0H0H0.O0H0、圖 1 ：果糖中 5-HMF 的生成途徑OHFructose5-HVUHOHO-H.OA5.0BU-0mV1530GroupDosage T .“九 z 、“九 / 、 Liver Index Spleen Index(mg/kg) m (g) ma s (g)(“00, mgg】) (xlOO, nigg】)表 1 5-HMF 對(duì)小鼠體重和臟器的影響30CHControlAlcohol Huganpian5-HMF35023.3 2.

19、622.6 2.123.1 2.922.8 2.623.2 2.727.5 = A5.0BU-0mV1530GroupDosage T .“九 z 、“九 / 、 Liver Index Spleen Index(mg/kg) m (g) ma s (g)(“00, mgg】) (xlOO, nigg】)表 1 5-HMF 對(duì)小鼠體重和臟器的影響30CHControlAlcohol Huganpian5-HMF35023.3 2.622.6 2.123.1 2.922.8 2.623.2 2.727.5 = 2.928.23.129.3 2.727.8 = 3.328.6 = 3.429.1

20、3.24.31 0.144.74 = 0.14*4.38 0.14 #4.31 =0.544.48 = 0.19 #4.51 = 0.14 #0.32 士 0.050.42 土 0.03 *0.36 0.04 #0.40 0.060.37 0.04 #0.35 0.03 #Values represent the mean 土 S.D., ” = 8:*p0.05 vs. contiol group: 0.05 vs. alcohol group: Wts: weights.300-2DC-40CF5-HMFmV50 CH100-mV-1r7 5t/min10.020CH10CF圖2五味子果實(shí)中的高效液相色譜圖樣品A和樣品B40C-L5-HMFGroupDosage (mg/kg)ALT(IVL)AST(IVL)TC(mM)TG(mM)L-DLC(mM)C ontrol3.91 0.6312.62 0.782.24 0.230.38 0.100.75 0.15Alcohol5.32 0.75 *28.22 0.71 *3.77 0.32 *2.15 0.28 *1.77 0.31 *Huganpian3504.02 0.44#21.25