大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件

1、種質(zhì)貯存 種質(zhì)貯存 一 引言 二 冷凍保存三 低溫貯存四 離體無性系冷凍的意義五 課后問題 一 引言 一 引言1 利用種子進(jìn)行種質(zhì)保存的優(yōu)缺點： 優(yōu)點：空間小，保存多年，易于干燥和包裝 局限性：隨著貯存時間的延長種子的生活力下降，病蟲害侵襲。 除了無融合生殖物種以外，難以保存各種來源不同的 無性系； 不適用于營養(yǎng)繁殖的作物。2 利用離體無性系培養(yǎng)物進(jìn)行進(jìn)行種質(zhì)保存的優(yōu)點： （1） 空間小 （2） 不受病蟲害侵襲 （3） 可以快速擴(kuò)繁 （4）便于國際間種至交流 3 離體無性系貯存的兩種方法： （1）冷凍保存 （2） 低溫貯存 一 引言國家種質(zhì)資源庫國家種質(zhì)庫是全國作物種質(zhì)資源長期保存與研究中心。

2、該庫在美國洛克菲勒基金會和國際植物遺傳資源委員會的部分資助下，于1986年10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院落成，隸屬于作物品種資源研究所。國家種質(zhì)資源庫國家種質(zhì)庫是全國作物種質(zhì)資源長期保存與研究中心國家種質(zhì)庫保存資源的對象保存對象：凡能通過種子繁殖維持物種遺傳完整性的各類植物種質(zhì)資源，都可保存到國家種質(zhì)庫，其種子應(yīng)是耐低溫和耐干燥類型，即正常型種子（orthodox seeds）。 貯存條件：溫度-18，相對濕度低于50%。根據(jù)理論上推算，含水量為5-8%的種子，在上述貯存條件下，其壽命可延長到50年以上。發(fā)芽率監(jiān)測結(jié)果表明，庫存大部分種子經(jīng)過15年貯藏，其發(fā)芽率沒有出現(xiàn)明顯的下降。因此，低溫貯藏是目前

3、種子體種質(zhì)的最佳保存途經(jīng)。位于北京中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院大院內(nèi)的新建成“國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心”保存設(shè)施，于2002年投入使用，使國家種質(zhì)庫長期貯存總?cè)萘吭黾拥?070萬余份。因此，凡能通過種子繁殖維持物種遺傳特性的植物種子都可送國家種質(zhì)庫保存。國家種質(zhì)庫保存資源的對象保存對象：凡能通過種子繁殖維持物種中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶植物種質(zhì)資源庫( 原“珍稀瀕危特有植物種質(zhì)資源庫”) 以種子和植物組織體為基本材料，收集、評價、保藏和分發(fā)我國熱帶、亞熱帶重要植物資源特別是稀有瀕危特有植物種質(zhì)資源中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶植物種質(zhì)資源庫( 原“珍稀瀕IRRIInternational Rice R

4、esearch InstituteIRRIInternational Rice Researc世界末日種子庫The Svalbard Doomsday Seed Vault位于距離北極點約1000 公里的挪威斯瓦爾巴群島的一處山洞中，約1 億粒世界各地的農(nóng)作物種子被保存在零下18 攝氏度的地窖中。此外，該種子庫堪稱全球最安全的基因儲存庫，其安全性堪比美國國家黃金儲藏庫，甚至可以抵御地震和核武器. 這座種子庫的建設(shè)目的，是把世界各地的各種植物種子保存在地下倉庫里，以防因為全球物種多樣性迅速減小造成物種滅絕。 世界末日種子庫The Svalbard DoomsdayConstruction beg

5、an in July 2006 on the Svalbard Global Seed Vault. Originally scheduled for completion in September 2007, the first seeds were delivered in February 2008.The remote location, harsh conditions and unique engineering were all challenges for builders. For nearly four months every year, the region is co

6、mpletely dark.Construction began in July 200攝影師卡洛琳波倫拍攝了把印度海得拉巴一農(nóng)場種植的植物種質(zhì)運輸?shù)脚餐澳┤铡狈N子庫的全過程。 國際半干旱熱帶地區(qū)作物研究院的科學(xué)家挑選合格的種子裝船。 國際半干旱熱帶地區(qū)作物研究院將為該種子庫捐獻(xiàn)出在印度生長的5種植物的20000個樣本。 攝影師卡洛琳波倫拍攝了把印度海得拉巴一農(nóng)場種植的植物種質(zhì)運種子選好后，他們會通過真空包裝，把這些種子裝到4層的特殊塑料袋里，并通過熱封口方式，去除潮氣。 這批從印度運來的種子到達(dá)斯瓦爾巴特群島，稍后將被運往挪威種子庫。 斯瓦爾巴德島全球種子庫(SvalbardGlobalS

7、eedVault)的管理員奧拉韋森在機(jī)場把這些種子集中到一起。 到達(dá)了到達(dá)由挪威政府建造，全球作物多樣性信托基金(TheGlobalCropDiversityTrust)經(jīng)營的斯瓦爾巴德島全球種子庫 ，可以儲存來自100個國家的1億種作物種子。 種子選好后，他們會通過真空包裝，把這些種子裝到4層的特殊塑料在把印度運來的種子放進(jìn)種子庫以前，韋森對出貨清單上的所有種子進(jìn)行核實。 斯瓦爾巴德島全球種子庫的儲藏區(qū)位于一座沙巖山下大約400英尺的地方。挪威之所以會選擇在這里建設(shè)種子庫，是因為這一地區(qū)地質(zhì)活動較少，而且處于永凍土地帶。由于這座山位于海平面以上430英尺的地方，即使冰雪融化，這座種子庫仍會很

8、干燥。 斯瓦爾巴全球種子庫冷藏溫度在零下18度，因大多數(shù)作物的種子都能保存上百年在把印度運來的種子放進(jìn)種子庫以前，韋森對出貨清單上的所有種子二 冷凍保存 1 定義 通過一定處理，把離體無性系保存在液氮中，使 培養(yǎng)物的活動處于停滯狀態(tài)，達(dá)到種質(zhì)保存的目的。 2 程序或步驟： 材料予處理 冷凍降溫 貯存 解凍 重新培養(yǎng) 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件二 冷凍保存3低溫對細(xì)胞的傷害和冷凍保護(hù)劑的必要性 （1） 低溫對細(xì)胞的傷害： A 細(xì)胞內(nèi)冰晶形成引起細(xì)胞破裂， 造成物理理損傷 B 自由水冷凍后引起細(xì)胞脫水，造成 生理傷害 （2）冷凍保護(hù)劑的作用： A 提高溶液的粘滯性，防止細(xì)胞內(nèi)大 冰

9、晶的形成，防止物理損傷 B降低冰點，促進(jìn)細(xì)胞膠質(zhì)的“玻璃 化”態(tài)形成， C 穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的正常結(jié)構(gòu) 特別是膜結(jié)構(gòu)，阻止低溫對其傷害 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件二 冷凍保存4 冷凍前的預(yù)處理 （1） 預(yù)處理的必要性：調(diào)整生理狀態(tài)（如滲透壓的調(diào)整） （2）采取的一般措施： 加入冷凍保護(hù)劑培養(yǎng)一段時間 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件3 取材： 1 分生能力較強(qiáng)的細(xì)胞或組織 A 莖尖 B 胚性愈傷組織 C 處于延遲后期或?qū)?shù)生長期的懸浮細(xì)胞 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件5 冷凍降溫 （1）冷凍降溫的幾種方法：

10、A慢凍法 ： 溫度下降速度為0.1-1攝氏度/分鐘 B快凍法： 溫度下降速度為50-1200攝氏度/分鐘 C 分步冷凍法： 先用慢速把溫度降低到-30 -50度，停留 一段時間，然后再快速投入到液氮罐中。事實上在實際操作過程中，三種方法沒有明顯的區(qū)分，大多數(shù)聯(lián)用。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件5 解凍和重新培養(yǎng) （1）解凍 一般措施：把材料從液氮罐中取出投入 3040度水浴鍋中（速度500-750度/分 鐘）。 （2）清洗 A 目的：去掉冰凍保護(hù)劑，降低滲透壓 B 清洗液一般為液體培養(yǎng)基 清洗有壞處嗎？為什么？如何應(yīng)對？5 解凍和重新培養(yǎng)

11、清洗有壞處嗎？為什么？如何應(yīng)對？ （3）培養(yǎng)物的存活率： A 理論存活率的公式： 重新生長的細(xì)胞或器官組織數(shù)目/解凍的細(xì)胞或器官組織數(shù)目 B 實際測定存活率的公式（方法）： 冷凍后的細(xì)胞活力/冷凍前的細(xì)胞活力 C 實際測定存活率的方法： 熒光素雙醋酸酯（FDA）法、 氯化三苯四唑（TTC）法 、 伊凡藍(lán)法 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)15種質(zhì)保存-組培課件三 低溫保存種質(zhì)也可以用離體培養(yǎng)的方式保存在非凍結(jié)程度的低溫下（1-9）植物材料的老化過程減慢，但不像在超低溫保存中完全停止，因此仍需繼代，但間隔時間延長。主要用于芽 苗的保存，費用低廉，時間較短 還會有那些保存方式？三 低溫保存還會有那些保存方式？

12、新型冷凍保護(hù)劑抗凍蛋白近20年來,低溫凍存技術(shù)的改進(jìn)極大地促進(jìn)了細(xì)胞工程的發(fā)展,而這一切又離不開冷凍保存劑的研究與探索。目前抗凍蛋白(Antifreeze Proteins,AFP)作為一種新型冷凍保存劑,已經(jīng)引起研究者的足夠重視,并成為目前的研究熱點之一隨著研究的不斷深入,抗凍蛋白有可能逐漸取代傳統(tǒng)的冷凍保存劑新型冷凍保護(hù)劑抗凍蛋白近20年來,低溫凍存技術(shù)的改進(jìn)極大脫水法原理：是在冷凍前先用人工的方法把待保存材料中的自由水脫除，以防止冷凍過程中結(jié)冰對細(xì)胞造成傷害。耐脫水的種子對脫水速率沒有要求，但頑拗性種子則需要快速脫水，而且常常是用胚或胚軸做超低溫保存的目標(biāo)材料?？焖倜撍梢酝ㄟ^活化硅膠吸

13、除水分或通過無菌氣流帶走水分來實現(xiàn)。在頑拗性/中間型種子方面，Grout等(1983)首先使用這一方法保存了油棕的胚，后來這一方法又被用來成功的保存了許多植物，如咖啡、蒲葵等脫水法原理：是在冷凍前先用人工的方法把待保存材料中的自由水脫包埋法和包埋脫水法包埋法是借用人工種子的技術(shù)發(fā)展起來的，其主要步驟是在冷凍前先把待保存材料懸浮在含有高濃度的甘油、蔗糖的海藻酸鈉溶液中，然后用滴管把待保存材料滴到含有相同濃度的甘油、蔗糖的氯化鈣溶液中，靜置一段時間讓海藻酸鈣螯合和固化，在待保存材料表面形成一個包裹層，成為包埋珠。在包埋處理的過程中，因為滲透脫水等原因待保存材料的低溫耐性有一定的提高，同時材料外的包

14、裹層又具有一定的保護(hù)作用，可以減輕接下來的脫水、玻璃化及冷凍處理對材料的傷害。包埋珠經(jīng)吸干表面水分后，可以直接用于冷凍保存。 如煙草懸浮細(xì)胞，但是更多的材料在包埋后還需要經(jīng)過進(jìn)一步脫水或玻璃化處理才能實施冷凍保存，具體情況依種而定。梨、葡萄的莖尖和胡蘿卜的體細(xì)胞胚是最早用包埋脫水法成功超低溫保存的材料。目前，文獻(xiàn)報道使用該方法成功實現(xiàn)超低溫保存的植物材料有近百種包埋法和包埋脫水法包埋法是借用人工種子的技術(shù)發(fā)展起來的，其主玻璃化法、包埋玻璃化法和微滴玻璃化法玻璃化是指液相物質(zhì)被過冷卻到深低溫，在冷凍過程中不出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象，并最終固化成無定形的玻璃樣狀態(tài)的過程。玻璃化法的原理是利用高濃度的玻璃化溶液

15、處理待保存材料，玻璃化溶液中有些成分可以引起細(xì)胞脫水，有些成分可以滲透進(jìn)入原生質(zhì)，從而極大的提高了原生質(zhì)的粘滯程度，因此在接下來的快速降溫過程中細(xì)胞內(nèi)的水分子來不及按冰晶方式排列而呈玻璃態(tài)，或只能形成極微小的冰晶，避免對細(xì)胞造成傷害。植物材料超低溫保存中常用的玻璃化溶液是PVS1、PVS2和PVS3。文獻(xiàn)記載使用玻璃化法成功超低溫保存的植物有130余種，絕大多數(shù)都是使用PVS2。包埋玻璃化法是先把材料包埋成海藻酸鈣的小珠，然后按玻璃化法的程序處理。到目前已有10多種植物材料用該方法成功實現(xiàn)了超低溫保存，其中山葵的頂端分生組織是最先使用這一方法的例子微滴玻璃化法是結(jié)合了玻璃化法和微滴法的技術(shù)，待保存材料先用玻璃化溶液處理，然后單個放到鋁箔片上的玻璃化溶液微滴中，投入液氮快速冷凍，因為表面張力的作用，操作過程中微滴并不會從鋁箔條上滑落。該方法是近些年創(chuàng)造出來的，目前用該法保存的植物材料也有10多種玻璃化法、包埋玻璃化法和微滴玻璃