血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、純化與鑒定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、 TOC o 1-5 h z 姓名：學(xué)號(hào)：專業(yè)年級(jí)：組別：生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)名稱血清清蛋白、 -球蛋白的分離、純化與鑒定實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)合作者指導(dǎo)老師評(píng)分XX 教師簽名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文請(qǐng)統(tǒng)一用：小四號(hào)，宋體，1.5倍行距；數(shù)字、英文用Times NewRoman； 標(biāo)題用： 四號(hào)，黑體，加粗。 需強(qiáng)調(diào)的地方請(qǐng)用藍(lán)顏色標(biāo)出。不得出現(xiàn)多行、多頁空白現(xiàn)象。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握鹽析法、凝膠層析法、離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法。2、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法。3、了解柱層析技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理1、粗提（鹽析法）：蛋白質(zhì)分子能穩(wěn)定存

2、在于水溶液中是因?yàn)橛袃蓚€(gè)穩(wěn)定因素：表面的電荷和水化膜。當(dāng)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時(shí)，蛋白質(zhì)分子可相互聚集沉淀而析出。鹽在水溶液中電離所形成的正負(fù)離子可吸引水分子，從而奪取蛋白質(zhì)分子上的水化膜，還可中和部分電荷使蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀，從而達(dá)到鹽析沉淀蛋白質(zhì)的目的。由于血清中各種蛋白質(zhì)顆粒大小、所帶電荷多少及親水程度不同，因此， 利用不同濃度的硫酸銨溶液分段鹽析，便可將血清中清蛋白和球蛋白從溶液中沉淀出來，達(dá)到初步分離清蛋白、球蛋白的目的。2、脫鹽（凝膠層析法）凝膠層析法利用蛋白質(zhì)與無機(jī)鹽類之間分子量的差異。當(dāng)溶液通過凝膠柱時(shí)，溶液所以流程較短，向前移動(dòng)速度較快，最先流出層析柱。而鹽的分子量較小，

3、可通過網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠顆粒，所以流程長(zhǎng)，向前移動(dòng)速度較慢，較晚流出層析柱。從而可達(dá)到去鹽的目的。3、純化（離子交換層析法）離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的的交換過程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱為陽離子交換劑。本實(shí)驗(yàn)采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負(fù)電荷的離子可與其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的離子則不能，這樣便可達(dá)到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點(diǎn)的不同可進(jìn)行分離。血清中各種蛋白質(zhì)的pI 各不相同，因此，在同一醋酸銨緩沖液中，各蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，可以通過DEAE離子交換層析將血清清蛋白和 -球蛋白分離出來。

4、4、純度鑒定（電泳）采用醋酸纖維素薄膜電泳對(duì)分離得到的清蛋白和 -球蛋白進(jìn)行純度鑒定，以正常血清樣品作對(duì)照。比較兩者電泳圖譜可定性判斷純化的清蛋白和 -球蛋白的純度。三、材料與方法：以流程圖示意材料：1、樣品：健康人血清（新鮮、無溶血、無沉淀物或細(xì)菌滋生）2、試劑：0.3mol/L 的 PH6.5醋酸銨緩沖液、0.06mol/L 的 PH6.5醋酸銨緩沖液、0.02mol/L的 PH6.5 醋酸銨緩沖液、1.5mol/L 的 NaCl-0.3mol/NH 4Ac 溶液、飽和硫酸銨溶液、0.92mol/L（ 20%）磺基水楊酸、0.05mol/L（ 1%） BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥緩

5、沖液、漂洗液。3、儀器及器材：層析柱、燒杯、移液槍、加樣槍、試管、濾紙、醋酸纖維素薄膜、黑色反應(yīng)板、鐵固定架、螺旋夾、離心管和離心機(jī)、培養(yǎng)皿、載玻片、濾紙、平頭鑷子、結(jié)果：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、現(xiàn)象、圖譜；討論：以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯結(jié)果：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、現(xiàn)象、圖譜；討論：以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯推論，并得出結(jié)論。結(jié)果：1、粗提（鹽析法）: 如圖 1 所示，往血清中緩慢滴加飽和硫酸銨溶液后，溶液變渾濁，呈乳白色。離心后，溶液分為上層的上清液和下層沉淀，上清液呈淺黃色（見圖3），沉淀為白色。如圖2 所示，使用移液槍吸取上清液，從而分離上清液和沉淀。沉淀加水后溶解，為無色溶液（見圖4）。1 血清加飽和硫酸銨溶液2 分離上清液

6、和沉淀3 上清液4 沉淀加水后溶解1 血清加飽和硫酸銨溶液2 分離上清液和沉淀3 上清液4 沉淀加水后溶解2、脫鹽（凝膠層析法）和純化（離子交換柱層析鑒定）：如圖5 所示，往層析柱中加樣前，應(yīng)先將層析柱中的上層液放出，用小燒杯接廢液，直至下液面離柱床約0.5cm。與葡聚糖凝膠G-25 層析柱相對(duì)比，DEAE-纖維素層析柱的液體流出速度更緩慢。如圖6 所示，往磺基水楊酸和BaCl2溶液中分別滴入流出液，生成白色沉淀，說明流出液中含有蛋白質(zhì)。白色沉淀越多，說明液體所含的蛋白質(zhì)越多，以此選取濃度最高的1 管球蛋白進(jìn)行醋酸纖維素薄膜電泳。5 DEAE-纖維素層析柱6 磺基水楊酸和蛋白進(jìn)行醋酸纖維素薄膜

7、電泳。5 DEAE-纖維素層析柱6 磺基水楊酸和BaCl2 檢測(cè)蛋白質(zhì)呈陽性藍(lán)色圓圈為BaCl2溶液）4、純度鑒定（電泳）：如圖7 所示將醋酸纖維素薄膜架于電泳槽上，進(jìn)行電泳。如圖8所示，染色后，薄膜上可見5 條深藍(lán)色橫紋。7 所示，染色后，薄膜上可見5 條深藍(lán)色橫紋。7 直流穩(wěn)壓電泳儀血清清蛋白第1管清蛋白第-球蛋白血清清蛋白第1管清蛋白第-球蛋白討論：1、操作失誤： 1）在進(jìn)行球蛋白的除鹽時(shí)，我們倒入球蛋白溶液后沒有打開夾子讓其進(jìn)入凝膠柱，而是接著倒入了1ml 0.02mol/L NH 4Ac 緩沖液，導(dǎo)致球蛋白被稀釋。2）血清中各組分分離結(jié)果不佳，可能是點(diǎn)樣過多。3）電泳圖譜不整齊，可能

8、是點(diǎn)樣不均勻，或電泳時(shí)薄膜未放正。2、注意事項(xiàng)：1）使用移液槍吸取上清液時(shí)，應(yīng)注意從大往小調(diào)節(jié)吸取體積，小心吸取，避免吸取沉2）血清中各組分分離結(jié)果不佳，可能是點(diǎn)樣過多。3）電泳圖譜不整齊，可能是點(diǎn)樣不均勻，或電泳時(shí)薄膜未放正。2、注意事項(xiàng)：1）使用移液槍吸取上清液時(shí)，應(yīng)注意從大往小調(diào)節(jié)吸取體積，小心吸取，避免吸取沉淀物。2）使用層析柱時(shí)，注意不要讓液面低于凝膠床/纖維素床表面，以免空氣進(jìn)入凝膠床/纖維素床。3）往層析柱加液體時(shí)，注意不要將凝膠粒/纖維素粒沖起，破壞凝膠床/纖維素床表面的平整。4）往層析柱加不同液體時(shí)，應(yīng)先讓上一種液體進(jìn)入柱床后再添加另一種液體，否則樣品會(huì)被稀釋，緩沖液等液體會(huì)

9、失去其該有的作用。5）流出一定量液體時(shí)，要及時(shí)用磺基水楊酸和BaCl2檢驗(yàn)流出液是否含有蛋白質(zhì)，以免蛋白質(zhì)流失過多。6）點(diǎn)樣線應(yīng)窄于薄膜寬度，以免發(fā)生邊緣效應(yīng)。7）點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散。但也不能太干，否則樣品不易進(jìn)入薄膜的網(wǎng)孔，導(dǎo)致電泳起始點(diǎn)參差不齊，影響分離效果。8）點(diǎn)樣線應(yīng)窄而均勻，否則電泳圖譜會(huì)不整齊。9）點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)做好標(biāo)記，以免弄混。標(biāo)記要明顯，以免染色漂洗后標(biāo)記模糊消失。3、討論題：1）硫酸銨鹽析一步, 為什么是0.8ml 血清加 0.8ml 飽和硫酸銨?在半飽和硫酸銨溶液中，血清清蛋白不沉淀， -球蛋白沉淀，0.8ml 血清和 0.8

10、ml飽和硫酸銨混合可以形成半飽和硫酸銨溶液從而達(dá)到分離的目的。但硫酸銨會(huì)水解呈酸性，如果濃度大的話酸性也很強(qiáng)，可能使蛋白質(zhì)變性。若將血清加入飽和硫酸銨，會(huì)使部分血清蛋白變性。所以要將硫酸銨慢慢加入血清，邊滴加邊搖勻。2）為什么實(shí)驗(yàn)中DEAE 纖維素柱分離 -球蛋白后不用再生, 可直接用于純化清蛋白?DEAE 纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負(fù)電荷的離子可與其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的離子則不能，這樣便可達(dá)到分離純化的目的。 -球蛋白帶正電荷，不與 DEAE結(jié)合，會(huì)從層析柱中首先洗脫出來，所以可直接用于純化清蛋白。3） 應(yīng)用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定分離純化后的血清清蛋白和 -球蛋白的純度, 根據(jù)什么來確定它是清蛋白還是 -球蛋白?判定它們純度的依據(jù)是什么?正常人血清蛋白經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳后可獲得5 條區(qū)帶。 -球蛋白的等電點(diǎn)約為7.3， 在 pH8.6 的巴比妥緩沖液中，帶的負(fù)電荷最少，在電場(chǎng)中比其它蛋白質(zhì)移動(dòng)速度慢。而清蛋白等其它蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)均小于7.3，在電場(chǎng)中比 -球蛋白移動(dòng)速度快。其中清蛋白等電點(diǎn)為4.88，帶負(fù)電荷最多，速度最快。且清蛋白在血清中含量最多。所以離點(diǎn)樣線最近的是 -球蛋白，離點(diǎn)樣線最遠(yuǎn)的最粗的