蛋白表達及菌體破碎問題

1、蛋白表達及菌體破碎問題我最近做蛋白表達時，蛋白表達量尚可，但就是在超聲波碎菌時老是破不 碎，后來 做了相同條件下未誘導菌體進行破碎，發(fā)現(xiàn)很容易破碎，請教列位大 俠這是怎么一回事 ?。课业木唧w操作如下：培養(yǎng)兩瓶200ml BL21 （ DE ） plysS4小時,OD值0.9,對其中一瓶加 入IPTG置37度誘導表達，IPTG終濃度為O.lmmol/1,另一瓶保持不 變。誘導過夜，離心 收獲菌體，PES洗滌兩次后30ml PES懸浮菌體，超聲破碎3（）分鐘（5秒、9秒）， 保證冰浴。然后對菌體裂解液分別以600（）轉、12000轉 離心，SDS檢測，發(fā) 現(xiàn)目的蛋白&菌體蛋白絕大部分存在于6000

2、轉沉淀中，上清中只有很少菌體蛋白（誘導 后的）；而未誘導的則沉淀很少，且菌體蛋白大部分存在于上清中。請各位大俠幫小弟 看看是怎么回事？是不是因為我的 蛋白表達影響到了菌體細胞壁的結構了？可我的蛋白 應該是包涵體表達啊，暈T!另外，在此前我做了大量的工作對菌體迸行破碎，包括反復凍融，溶菌酶，鹽酸月瓜（l- 3mol/L,我不想用太高濃度的，盡管可以），DOC, SKL還有一些文獻上介紹的一些裂解 液配方，均無法破碎，我簡直要無語了！我最近在做蛋白表達用的是 PET和DE3我也有一些問題不懂，希望可以 和你 一路探討學習。我表達的是分泌型蛋白，以下是我對你實驗的拙見：1誘導的溫度是 否可以在重新調

3、超青的能量你用的多大的數(shù)值？是否在保證蛋白不變性的前提下，加大超青 條件， 超聲時間適當可以延長。直到菌液清亮透明（黃油狀）3取溶菌酶作用的最佳濃度，同時在反復凍融的過程中要不時的調節(jié) pH到它可以發(fā)揮 最大效力的數(shù)值破包涵體以尺其它方法的過程怎么樣？你用SDS檢測沉淀中的目的蛋白的分于量怎么樣？6蛋白表達影響菌體細胞壁的結構這一問題我也想知道誘導溫度我以前用的2（）度，后來發(fā)現(xiàn)37度誘導表達量較高就采用了 37度， 但對破碎效果的影響我正準備再試試。我用的超聲儀屬于前輩級機器（但保證能用），我也不知道具體功率的大小，只知道 以往所用均為35% 45%,我用的是38%。超聲時間我延長過，但誘導

4、后 的始終均是渾濁 菌體懸液。甚至有時發(fā)生分層，估計是變性了。溶菌酶我用的效應濃度為lmg/ml, PH8.0, 37度水浴lh,不管用。不知道你一般用多少 濃度？溶菌酶能否與其它一些低濃度的離液劑或者去污劑聯(lián)用？凍融法也用過，-20-37度，3次，不管用。再者就是一些裂解液，效果實在 讓人郁 悶。SDS檢測沉淀中確實是目的蛋白，與全菌直接檢測分子量相同。不知 你對這 一點有什么想法？不知哪位大俠對蛋白表達是否會影響菌體胞壁結構這一問題不吝賜教？誘導溫度的選擇是以什么為標準(產量與表達蛋白的分離率)建議查文獻 核實2菌液離心后上清做 SDS檢測。看是否有目的蛋白，并收集。多次洗細菌沉淀 并重懸

5、細菌，超聲只破碎離心收集的細菌細胞(防止菌液內已經有的蛋白在超聲時與細菌 一起超聲變性發(fā)生分層)3超言破碎細菌細胞，并純化包含體后裂解釋放包涵體，離心收集上清跑電泳看是否有目的蛋白，有收集，并收集包含體，對其處理如下(包含體的處理是我在園于里找到的， 你在園于里搜索一下)10 000 r min - 1 離心 15 min，棄上清。將沉淀用3 mol - L-1尿素含0.2g- L-l TriionX2100反復洗滌處置取得純化的 包涵體，稱 重。包涵體用8 mol - L-1尿素含1() mmol - L-1二硫蘇糖醇(DTT)溶解變性。復性：包涵體溶解變性后10 OCX) r min-1離

6、心15 min，清除不溶性雜質。上清直接用復性液:50 mmol - L-1 Tris Cl, 1 mmol - L-1 EPTA , 1 mmol L-1苯甲基磺酰氟 (PMSF)，不同濃度的氧化型谷胱甘肽(GSSG),還原型谷胱甘肽(GSH)稀釋，使蛋白質終 濃度不超過100 mg - L-1,尿素終濃度為0. 5 1. 0 mol-L-1 ；在其他條件不變的情況下， 別離改變GSSG和GSH濃度、溫度尺復性 時間，PEG2()0()()濃縮后，離心。測上清總蛋白質量，計算復性率，找出最佳復性條件。溶菌B lOmg/mlo在作用過程中菌液的pH會下將，所以最好多次重新調節(jié) pH8(你查一下

7、它的作用原理以尺大腸桿菌的特性就知道)凍融法我們是10次，最少六次6我感覺蛋白表達影響菌體細胞壁的結構的可能性較小，主要還是包含體的處理上(我 也是新手)見笑了，供大家一起學習關于前輩級機器，如果前輩用可以，那么你應該在自己漠漠條件了，1菌體破碎的檢測指標：鏡檢，才可直觀知破全沒有？2反復凍融，溶菌酶，鹽酸弧(l-3mol/L,我不想用太高濃度的，盡管可以)，DOC, SKL還 有一些文獻上介紹的一些裂解液配方，均無法破碎？這些方法我都試過，菌是BL21 (DE3)均無問題你不成功的原因可能在于細節(jié).未誘導的則沉淀很少，且菌體蛋白大部分存在于上清中結論是對的4.IPTG置37度誘導表達，IPT

8、G終濃度為lmmol/1, 3.545小時是最佳時間、再 長則減 你可做單因于優(yōu)化.5.超肖破碎3()分鐘(5秒、9秒)，保證冰浴。然后對菌體裂解液分別以6()0()轉、120()0 轉離心，SDS檢測，發(fā)現(xiàn)目的蛋白尺菌體蛋白絕大部分存在于6000轉沉淀中，上 清中只有很少菌體蛋白(誘導后的)結論正確，但還可優(yōu)化但要注意超聲的聲音，如聲音有異，則是沒有工作原因參數(shù)設置不對，產熱，溫度高， 間隔時間太短如還有問題MSN伺名帳號，工作時間在線.謝謝的回答與建議。今明天我會再做一下IPTG誘導表達，溫度20 度，IPTG 0.1mmol/Lo鏡檢或許是檢測菌體破碎的金指標，但如果菌體有破碎，包含體是

9、不應該在600()轉 沉淀下來啊，分級離心后電泳檢測應該也可以說明一點問題。不過下面我會用鏡檢做一 下看。反復凍融、鹽酸孤(l-3mol/L)我重復過，確實不行。溶菌酶有可能是PH控制不好，我 會重做再試試。D()C我用2%,懸浮后能釋放核酸(懸液變粘稠)，但超言破碎效果確實不 行，我分別取了 2()分鐘、6()分鐘和9()分鐘的超聲裂解液電泳檢測。SKL效及其它只做 過一次，效果更差。IPTG誘導我做過優(yōu)化，終濃度()1和lmmol/L沒有太大區(qū)別，所以我一直用0.1。我一直搞不明白，同等超聲條件下為什么未誘導菌體可以很容易破碎，而誘導表達后就不容易破碎了呢？這應該不是超言的原因吧，否則未誘

10、導的也不應 該破碎啊1用不用溶菌酶都無多大關系，DOC用2%,懸浮后并不能釋放核酸，懸液變粘稠是由于DOC.3.IPTG誘導我做過優(yōu)化，終濃度().1和lmmol/L沒有太大區(qū)別，所以一直用0.1?優(yōu)化方法 不對同時做時間雙因于培養(yǎng)基多因于溫度20度可分泌表達，誘導過夜4破碎只用緩沖液即可包含體是不應該在6000轉(4()000可沉淀80%你以前以為破菌不完全的原因：誘導時間太長，沒有人在37度誘導過夜，這樣的話菌都已經死了，而且都自溶T,所以你 離心收菌得到的已經都是包涵體和少量沒有自溶的菌體，這樣無論怎么破菌上清里都沒 有多少菌體蛋白了。你的沒有加1PTG的對照就很正常，沒 有這種自溶現(xiàn)象

11、。不知道你的6000轉無法離心下來包涵體的概念是怎么來的。首先6000轉的說法 就不科 學，應該根據(jù)你使用的轉頭半徑大小換算成9,才能反映真實離心力大小，現(xiàn)在的新離心機 上都能直接看到go再說一般的轉頭6000轉已經能把大部分包涵體沉淀下來了，如果時 間夠長，包涵體基本上都能沉淀下來。你的電泳照片顯示你的目的蛋白在包涵體6000轉已經把90%以上的包涵體沉淀下來To 12000轉出現(xiàn)的兩條主要的雜帶我認為不存在于包涵體里，而是位于細胞膜上的膜蛋 白，12()00轉(拜托換算成0把細胞膜的大碎片離心沉淀下 來了。建議只用6000轉離心下來的還算比較純的包涵體，扔掉12000轉的沉淀。1, 37度

12、誘導留宿致使菌體死亡破裂，不是因為你的plyss菌自身表達溶菌 酶的原 因，而是由于ipig的細胞毒性，一旦誘導，細胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達的 方面轉化。在通常情況下，細胞將停止生長，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。 在37度環(huán)境中，34小時內細胞都不會死亡。但是如果過夜誘導，在這樣的溫度和營養(yǎng)已經耗盡的情況下，細胞應該會死掉一些，正 好你的plyss菌自身的溶菌酶會加速這個過程，所以才會出現(xiàn)你描述的情況。所以大家 在37度誘導時都是只誘導3-4小時。因為沒有人在37度誘導過夜，所以找不到根據(jù)支持我的觀點，你涂平板的結果也不太能 說明問題，我并沒有說你的菌全部死掉了，不過你可以做一個稍微嚴 謹一點的試驗來驗 證一下我的推斷，在同樣的條件下37度過夜搖你的表達菌，一個加iptg, 一個不加，然 后分別稀釋到合適的濃度涂平板培養(yǎng)，計算活菌數(shù)，我估計將會有1到2個數(shù)量級的差 別。如果你看過包涵體的電鏡照片，你會發(fā)現(xiàn)包涵體還是很大個的，直徑跟細菌差不多，而且密度很大，肯定是可以在60()()轉離心下來的。你可以看看這個protocol，也 許對你的試驗有幫助。他們就是600()轉離心包涵體，CuntriFugclocollect inclusion bodies (fbr example, 6000 rpm for 15 minu