蛋白質(zhì)的鑒定方法

1、蛋白質(zhì)的鑒定方法雙縮脲NaOH，是 Cu（OH）2因?yàn)殍b定蛋白質(zhì)的原理是，肽鍵在堿性條件下會(huì)和Cu離子發(fā)生反應(yīng)，形成紫色絡(luò)合物。而Cu離子本身在堿性條件下會(huì)形成Cu（OH）2藍(lán)色沉淀。斐林試劑雙縮脲試劑A的成分是氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g/mL的水溶液；雙縮脲試劑B的成分是硫酸銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 g/mL的水溶液。斐林試劑是德國化學(xué)家斐林（Hermann von Fehling，1812年-1885年）在1849年發(fā)明的。它是由氫氧 化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g/mL的溶液和硫酸銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05 g/mL的溶液（其實(shí)還有酒石酸） 所以，對比一下，就可以發(fā)現(xiàn)，要把硫酸銅溶液稀釋免疫印

2、跡法免疫印跡法是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用 抗體進(jìn)行檢測。對巳知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗 體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被 檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分 離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免 疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳

3、分離的 特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。蛋白質(zhì)組研究技術(shù)體系的總流程，它主要包括；樣品制備技術(shù)、雙向凝膠電泳（2DE）技術(shù)、凝膠圖像分 析技術(shù)、蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索技術(shù)、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫構(gòu)建與功能分析。雙向凝膠電泳（2DE）2DE的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS PAG分離，在二維平面上分開復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)。近年來經(jīng)過多方面改進(jìn)巳成為研究蛋白質(zhì)組 的最具實(shí)用價(jià)值的核心方法。染色2DE分離后蛋白質(zhì)的可視性是很重要的一步，不同的可視性技術(shù)的敏感度對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響不同， 即2DE結(jié)果

4、須經(jīng)過染色、脫色等處理方能檢測分析。常用的染色方法有銀染法、考馬斯亮藍(lán)染色法、無機(jī) 鹽負(fù)性染色法，另外還有以下幾種染色試劑均可采用：麗春紅S、氨基黑、印度墨水、35硫脲銀、膠態(tài)金、 咪唑鋅等。此外，亦有采用免疫抗體結(jié)合染色和放射性標(biāo)記等方法檢測蛋白。目前，沒有一種蛋白染色法 覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術(shù)。其中銀染法靈敏度較高，可達(dá)25ug，較考馬斯亮藍(lán)R 250 高出約50100倍，有利于蛋白質(zhì)組復(fù)雜而微量蛋白成分的顯示，因此銀染法被廣泛用于2DE分離后蛋白 質(zhì)點(diǎn)的染色，但對質(zhì)譜測定有干擾，必須先脫銀。凝膠圖像采集與分析將染色蛋白的圖像轉(zhuǎn)化為電信號(hào)是進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)的定性和定量分析的關(guān)鍵步

5、驟。滿天星式的 2DE圖像分析不能依靠本能的直覺，每一個(gè)圖像上斑點(diǎn)的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失，都可能在生理和病理 狀態(tài)下產(chǎn)生，必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行定性、定量分析。蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定技術(shù)采用質(zhì)譜法鑒定經(jīng)2DE分離后的交內(nèi)蛋白質(zhì)是目前蛋白質(zhì)組研究中主要的支撐技術(shù)。目前，對于蛋白質(zhì) 組研究樣品中的大量蛋白而言，通常的質(zhì)譜分析分為兩個(gè)層次。其一是以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間 質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)或電噴霧電離質(zhì)譜(ESIMS)為基礎(chǔ)，進(jìn)行高通量的蛋白和多肽質(zhì)譜指紋分析， 這一水平的分析結(jié)果中單一蛋白的信息含量低。其二應(yīng)用質(zhì)譜連用(MS/MS)進(jìn)行低通量的蛋白和多肽片段 的指紋分析，得到單一蛋白高信息含量的分析結(jié)果。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(Proteome database)被認(rèn)為是蛋白質(zhì)組知識(shí)的貯存庫，它貯存了有機(jī)體、組織或細(xì) 胞所表達(dá)的全部