體外診斷試劑臨床研究講義課件

1、體外診斷試劑的臨床研究 體外診斷試劑臨床研究講義1體外診斷試劑的臨床研究 體外診斷試劑臨床研究講義1體外診斷試劑的種類(lèi)化學(xué)或生化檢測(cè)試劑免疫學(xué)檢測(cè)試劑抗原檢測(cè)抗體檢測(cè)核酸檢測(cè)試劑核酸雜交技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)其他試劑體外診斷試劑臨床研究講義2體外診斷試劑的種類(lèi)化學(xué)或生化檢測(cè)試劑體外診斷試劑臨床研究講義核酸擴(kuò)增技術(shù)目的片段的擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)（TAS）鏈取代的擴(kuò)增技術(shù)（SDA）探針的擴(kuò)增連接擴(kuò)增反應(yīng)（LAR）以FEN-1 DNA聚合酶為基礎(chǔ)的擴(kuò)增循環(huán)探針信號(hào)擴(kuò)增體外診斷試劑臨床研究講義3核酸擴(kuò)增技術(shù)目的片段的擴(kuò)增體外診斷試劑臨床研究講義3免疫檢測(cè)的原理直接法間接法體外診斷

2、試劑臨床研究講義4免疫檢測(cè)的原理直接法體外診斷試劑臨床研究講義4免疫反應(yīng)中按標(biāo)記物分類(lèi)同位素標(biāo)記的放射免疫法酶標(biāo)記的酶聯(lián)免疫法生物素標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光法熒光素標(biāo)記時(shí)間分辨法其他標(biāo)記物體外診斷試劑臨床研究講義5免疫反應(yīng)中按標(biāo)記物分類(lèi)同位素標(biāo)記的放射免疫法體外診斷試劑臨床臨床研究的意義以及目的臨床前樣品雖有代表性，但數(shù)量畢竟有限并不能完全代表臨床情況通過(guò)臨床試驗(yàn)對(duì)臨床前制定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行修正可以發(fā)現(xiàn)或預(yù)測(cè)在實(shí)際應(yīng)用中遇到的問(wèn)題，在說(shuō)明書(shū)中提醒用戶(hù)注意體外診斷試劑臨床研究講義6臨床研究的意義以及目的臨床前樣品雖有代表性，但數(shù)量畢竟有限并臨床研究的基本要求倫理考慮一般樣品特殊樣品對(duì)研究對(duì)象

3、保密臨床前研究結(jié)果體外診斷試劑臨床研究講義7臨床研究的基本要求倫理考慮體外診斷試劑臨床研究講義7對(duì)臨床研究單位以及人員的要求從事相應(yīng)的工作具有相應(yīng)的技術(shù)人員有相應(yīng)的儀器設(shè)備 如果試劑對(duì)儀器無(wú)特殊要求，則應(yīng)選擇不同品牌或不同型號(hào)有不同專(zhuān)業(yè)人員參加至少兩家省級(jí)單位對(duì)實(shí)施實(shí)驗(yàn)單位的能力進(jìn)行評(píng)價(jià) 指綜合能力包括檢測(cè)能力、儀器設(shè)備和人員等,主要檢測(cè)盲樣，符合要求這方能參與體外診斷試劑臨床研究講義8對(duì)臨床研究單位以及人員的要求從事相應(yīng)的工作體外診斷試劑臨床研對(duì)照方法或試劑的要求新診斷試劑疾病癥狀以及臨床診斷相關(guān)試劑研究對(duì)象的追蹤隨訪(fǎng)疾病的判斷標(biāo)準(zhǔn)已有同類(lèi)產(chǎn)品的試劑 可選擇同類(lèi)試劑; 若評(píng)價(jià)試劑所用的原料為

4、基因工程產(chǎn)品，應(yīng)用非基因工程 原料制備的試劑進(jìn)行評(píng)價(jià)；對(duì)結(jié)果不一致樣品的處理 體外診斷試劑臨床研究講義9對(duì)照方法或試劑的要求新診斷試劑體外診斷試劑臨床研究講義9臨床樣品的選擇人群: 根據(jù)試劑的適應(yīng)癥選擇不同的人群樣品: 應(yīng)為自然人群，尚未用同類(lèi)試劑進(jìn)行篩查過(guò)選擇不同地區(qū): 代表被測(cè)物的不同流行率，代表被測(cè)物的不同基因型或血清型疾病的時(shí)期: 樣品的數(shù)量: 體外診斷試劑臨床研究講義10臨床樣品的選擇人群: 根據(jù)試劑的適應(yīng)癥選擇不同的人群體外診斷檢測(cè)方法盲法平行檢測(cè)結(jié)果不一致樣品的進(jìn)一步分析體外診斷試劑臨床研究講義11檢測(cè)方法盲法平行檢測(cè)體外診斷試劑臨床研究講義11診斷試劑的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo) 靈敏度 （

5、Sensitivity）：在陽(yáng)性樣品中檢出陽(yáng)性樣品的百分比特異性（Specificity）：在陰性樣品中檢出陰性樣品的百分比樣品分布 (eg. STDEV; ) Suitability of cut-off陰性預(yù)期值 (NPV)：若樣品沒(méi)有反應(yīng)，則不含檢測(cè)物的可能性陽(yáng)性預(yù)期值 (PPV)：若樣品有反應(yīng)，則含檢測(cè)物體的可能性重復(fù)性（Reproducibility）準(zhǔn)確性（Accuracy) 精確性 (Precision）體外診斷試劑臨床研究講義12診斷試劑的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo) 靈敏度 （Sensitivity）：靈敏度定義：試劑的檢測(cè)限度方法：檢測(cè)一定數(shù)量的陰性樣品，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差 均值和標(biāo)準(zhǔn)差，臨

6、界值等于均值加上2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差意義：在臨界值以上的樣品有95%為真陽(yáng)性 臨界值的評(píng)估：檢測(cè)一系列正常人群、非正常人群和特殊人群對(duì)臨界值進(jìn)行核對(duì)表示方法：以量值表示（如ng，單位，CFU/ml，PFU/ml，拷貝數(shù)等）；以稀釋度表示 體外診斷試劑臨床研究講義13靈敏度定義：試劑的檢測(cè)限度體外診斷試劑臨床研究講義13影響靈敏度的因素特殊疾病 有一些特殊的病人，其代謝異?？赡苡绊憳?biāo)志物的檢測(cè)干擾物質(zhì)或抑制物質(zhì) 可以來(lái)自與病人（藥物）；也可來(lái)自于樣品的處理過(guò)程（反復(fù)凍融，溶血等）；或樣品本身存在抑制物等樣品基因型和血清型的影響 有些被測(cè)物存在多種基因型或血清型，若原材料沒(méi)有廣譜性，則可影響靈敏度試劑的灰區(qū)

7、： 對(duì)特殊的試劑要制定灰區(qū)，如FDA要求HCV抗體試劑臨界值以上均為灰區(qū)，對(duì)灰區(qū)樣品要加倍重試體外診斷試劑臨床研究講義14影響靈敏度的因素特殊疾病體外診斷試劑臨床研究講義14核酸檢測(cè)抑制物的作用原理核酸擴(kuò)增需要酶的參與酶發(fā)揮作用需要輔助因子以及特殊的條件輔助因子與酶的特殊部位物理結(jié)合后發(fā)生反應(yīng)任何結(jié)合輔助因子、改變環(huán)境或阻止酶與輔助因子特異結(jié)合的物質(zhì)均抑制反應(yīng)體外診斷試劑臨床研究講義15核酸檢測(cè)抑制物的作用原理核酸擴(kuò)增需要酶的參與體外診斷試劑臨床核酸擴(kuò)增常見(jiàn)的抑制物血紅素及其代謝物影響DNA聚合酶的反應(yīng)，不同來(lái)源的DNA聚合酶受影響程度不同痰中的酸性多聚糖或糖蛋白均影響DNA聚合酶的反應(yīng)腦脊液

8、和尿中可能含有抑制物，但具體物質(zhì)不明確糞便中的膽汁鹽是PCR反應(yīng)的強(qiáng)抑制劑肝素可與DNA聚合酶結(jié)合，對(duì)不同的酶抑制程度不同核酸提取試劑中的某些物質(zhì)具有抑制作用：EDTA，SDS，鹽酸胍等體外診斷試劑臨床研究講義16核酸擴(kuò)增常見(jiàn)的抑制物血紅素及其代謝物影響DNA聚合酶的反應(yīng)，內(nèi)標(biāo)的種類(lèi)未修飾性的內(nèi)標(biāo)異源性?xún)?nèi)標(biāo)修飾性的內(nèi)標(biāo)體外診斷試劑臨床研究講義17內(nèi)標(biāo)的種類(lèi)未修飾性的內(nèi)標(biāo)體外診斷試劑臨床研究講義17特異性定義：主要指假陽(yáng)性的檢出情況評(píng)價(jià)方法：主要是通過(guò)檢測(cè)部分樣品，或特殊樣品尤其是性質(zhì)相近的標(biāo)志物（如不同基因型或血清型樣品），分析出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況；而且分析時(shí)要注意在不同量時(shí)的特異性體外診斷試劑臨

9、床研究講義18特異性定義：主要指假陽(yáng)性的檢出情況體外診斷試劑臨床研究講義1造成非特異性的因素原料：主要純度不夠，原料本身存在非特異反應(yīng) 物質(zhì)反應(yīng)模式：如孵育時(shí)間縮短非特異反應(yīng)可提高 3-4倍，非常短時(shí)可高達(dá)10倍樣品中的干擾物質(zhì)：病人本身：如自身免疫性疾?。ǜ呙庖咔虻鞍籽Y等），黃疸類(lèi)、溶血類(lèi)和高脂類(lèi)病人病人使用特殊藥物樣品處理過(guò)程：如不同抗凝劑，不同試管，某些 化學(xué)或去污劑以及樣品反復(fù)凍融等因素體外診斷試劑臨床研究講義19造成非特異性的因素原料：主要純度不夠，原料本身存在非特異反應(yīng)核酸檢測(cè)中造成非特異性的因素交叉反應(yīng)：主要是引物序列與被測(cè)物中序列存在一定程度的同源性樣品之間的污染：氣溶膠中含

10、有目的微生物，對(duì)照的污染等擴(kuò)增產(chǎn)物的污染：擴(kuò)增產(chǎn)物聚集在器皿、臺(tái)面、設(shè)備以及通風(fēng)設(shè)施上等造成污染體外診斷試劑臨床研究講義20核酸檢測(cè)中造成非特異性的因素交叉反應(yīng)：主要是引物序列與被測(cè)物污染的處理酶的滅活（UNG） 主要用于滅活產(chǎn)物光化學(xué)處理 用可溶性psoralen的衍生物處理，在用長(zhǎng)紫外照射 即可滅活產(chǎn)物、也可減少樣品的污染化學(xué)處理方法 用于表面的處理 10%次氯酸鈉 紫外照射物理的: 專(zhuān)用移液器、一次性試管架、紫外燈、PCR工作罩、濾芯吸嘴。體外診斷試劑臨床研究講義21污染的處理酶的滅活（UNG） 主要用于滅活產(chǎn)物體外診斷試劑臨樣品典型的正態(tài)分布NegativepopulationPosi

11、tivepopulationFrequency of observations0100110Percentage of maximum signal (log)Cut-off體外診斷試劑臨床研究講義22樣品典型的正態(tài)分布NegativePositiveFrequ特異性與值關(guān)系的分析企業(yè)假陽(yáng)性特異性（%）值金豪萬(wàn)泰GBI耀華科華麗珠華美新創(chuàng)普生綠科中山理利Murex梅里埃 32510327151822114 99.7099.8099.4999.9010099.7099.8099.2998.4899.9099.1997.7798.8899.59 -3.985-3.688-3.423-3.364-3

12、.687-2.741-4.337-3.636-2.261-3.060-2.778-1.774-3.551-4.311 樣品庫(kù)有985份樣品。特異性與其“”值相關(guān)性系數(shù)為0.691,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004） 體外診斷試劑臨床研究講義23特異性與值關(guān)系的分析企業(yè)假陽(yáng)性特異性（%）值金豪399. d - d+ 值的計(jì)算以及意義 delta = d / SDcut-offlog10 OD/COXX 0FrequencyOD/CO data must be transformed to log10 values before the analysis體外診斷試劑臨床研究講義24 d - d

13、+ 值的計(jì)算以及意義 數(shù)值的計(jì)算樣品的實(shí)際狀態(tài) + - +檢測(cè)結(jié)果 - A B C D A+B C+D A+C B+D靈敏度= A/（A+C);特異性=D/（B+D）陽(yáng)性預(yù)期值:1)簡(jiǎn)單的計(jì)算方法即：PPV=A/（A+B） 可以給出一個(gè)大約的數(shù)值; 2)精確的計(jì)算方法即：PPV= 流行率敏感性/流行率敏感性+（1-流 行率）（1-特異性)陰性預(yù)期值:1)簡(jiǎn)單的計(jì)算方法即：NPV=D/（C+D） 可以給出一個(gè)大約的數(shù)值 2)精確的計(jì)算方法即：NPV=(1- 流行率）特異性/（1-流行率） 特異性 + 流行率（1-敏感性) 體外診斷試劑臨床研究講義25數(shù)值的計(jì)算樣品的實(shí)際狀態(tài) + A B精確性(P

14、recision)作用：評(píng)價(jià)試劑的隨機(jī)誤差通過(guò)重復(fù)檢測(cè)某一或某些特定樣品并分析其一致性，通常以變異系數(shù)或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示樣品的要求：最好應(yīng)含有高、中、低三類(lèi)每一類(lèi)樣品至少檢測(cè)4次，實(shí)際上檢測(cè)10次或10次以上體外診斷試劑臨床研究講義26精確性(Precision)作用：評(píng)價(jià)試劑的隨機(jī)誤差體外診斷準(zhǔn)確性（accuracy)主要評(píng)價(jià)試劑的系統(tǒng)誤差，反映樣品的檢測(cè)值和真實(shí)值的一致性表示方法： 偏差（%）=（檢測(cè)值-真實(shí)值）X100/真實(shí)值評(píng)價(jià)方法： 1.在某一樣品中加上已知量的檢測(cè)物重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)值與預(yù)期值的偏差 2.檢測(cè)已知量的參考品，計(jì)算檢測(cè)量與標(biāo)化量的偏差體外診斷試劑臨床研究講義27準(zhǔn)確性（accuracy)主要評(píng)價(jià)試劑的系統(tǒng)誤差，反映樣品的定量范圍定義：能夠給出準(zhǔn)確量值的范圍建立的方法：主要對(duì)系列稀釋樣品的反復(fù)檢測(cè) 制定的定量曲線(xiàn)：線(xiàn)性或非線(xiàn)性要求：對(duì)定量范圍的上限和下限樣品進(jìn)行檢測(cè) 時(shí)，其精確性仍能符合要求體外診斷試劑臨床研究講義28定量范圍定義：能夠給出準(zhǔn)確量值的范圍體外診斷試劑臨床研究講義重復(fù)性（Reproducibility）不同實(shí)驗(yàn)次數(shù)之間（Run-run）不同實(shí)驗(yàn)室之間（Site-site）不同實(shí)驗(yàn)人員之間（Oper