人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取課件

1、人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取RT-PCR的原理、方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用第六組人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取 真核細(xì)胞質(zhì)總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物RNA的不穩(wěn)定性 由于核糖殘基的2和3位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活。 所以需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性。異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂

2、解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。 （2）RNA提取的一般步驟RNA提取的一般步驟是：破碎組織分離RNA沉淀RNA洗滌RNA融解RNA保存RNA洗滌RNA使用70乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步

3、可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于長(zhǎng)期貯存也應(yīng)該如此。 由于RNA的種類來源很多，因而提取制備方法各異。本次介紹的是Trizol法制備RNA。Trizol法提取RNA TRIzol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性，因此對(duì)純化RNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生

4、產(chǎn)十分有用?！驹噭?DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，異丙醇，無水乙醇，0.050.1DEPCH2O，75乙醇，TE緩沖液，瓊脂糖?！九渲啤?.DEPC水： 1ml1000ml雙蒸水1 DEPC水，1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)。2.75%乙醇：無水乙醇+DEPC水，-20保存（DEPC水需先高壓）實(shí)驗(yàn)用品基本過程 一、抽提 二、分相 三、RNA沉淀 四、RNA清洗二、分相3.在裝有裂解物的離心管中加入0.2ml的氯仿(為Trizol總體積的1/5),振蕩 混勻30秒，室溫下靜置5分鐘.4. 12000 rpm離心15分鐘4C,分相為三層。上層：RNA(約為Trizol的 60%)；中間：DN

5、A；下層:蛋白質(zhì)(酚-氯仿)。5.小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一EP管中。1ml裂解物產(chǎn)生的上清液體積 約為0.40.6 ml。有機(jī)相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì),避免觸及。三、RNA沉淀6.上清液加入約0.5ml的異丙醇,振蕩30秒混勻。室溫下靜置10分鐘。7.4C，離心12000rpm 10分鐘。8. RNA沉淀將在離心底的側(cè)面形成。小心吸棄上清液,注意避免吸棄RNA 沉淀。四、RNA清洗9.離心管加入1ml 預(yù)冷的75%乙醇(1mlTrizol至少用1ml乙醇清洗DNA),振蕩混勻30秒，使沉淀振蕩起來，室溫離心12000rpm12分鐘。盡可能吸棄上清液,防止RNA沉淀丟失。重復(fù)以上清洗步驟一

6、次。在75%乙醇中，RNA在4至少可以保存1周，20至少可以保存1年。10.室溫選擇流動(dòng)性小，倒置離心管于濾紙上，干燥RNA，但不能完全干燥(510分鐘)。用DEPC水15l溶解沉淀，55-60孵育1015分鐘。11.測(cè)量OD值后，樣品放置70保存，一個(gè)月RT-PCR RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。應(yīng)用 RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RN

7、A。廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。oligo: 多聚體，相當(dāng)于mRNA引物AMV RT：禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs：脫氧核苷酸RNase：RNA水解酶PCR Buffer：RT-PCR緩沖液MgCl2：2價(jià)鎂離子基本過程 由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶即逆轉(zhuǎn)錄酶來完成。 隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。 原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補(bǔ)DNA。瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳檢測(cè) 在基因組DNA的提取中，用蒸餾水溶解提取出的DNA，在1.0%