蛋白質(zhì)-醫(yī)學知識課件

1、第六節(jié) 蛋白質(zhì)的測序 (peptides) 一、肽的定義與肽鍵二、肽的書寫三、自然界中存在的小肽四、肽的理化性質(zhì)第六節(jié) 蛋白質(zhì)的測序 (peptides) 一、肽的定義與肽蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)學說的證據(jù)：肽鍵是一個酰胺鍵。（1）蛋白質(zhì)水解前后的結(jié)果分析。（2）人工合成的多肽和天然蛋白質(zhì)，都可被蛋白水解酶水解，人工合成多肽中氨基酸是肽鍵連接的。（3）天然蛋白質(zhì)有雙縮脲反應(yīng)。（4）人工合成的聚合aa的X-光衍射譜和紅外光譜與天然纖維蛋白相似。（5）結(jié)晶牛胰島素的成功，完全證明了蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)學說的正確性。一、蛋白質(zhì)中氨基酸之間的連接鍵是主要的是肽鍵 蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)學說的證據(jù)：肽鍵是一個酰胺鍵。一、蛋白質(zhì)

2、中氨基NH2COOH1NH2COOH2NH2C NCOOHOH21兩個氨基酸分子頭尾連接起來肽鍵的形成脫水CarbodiimideJuang RH (2004) BCbasicsNH2COOH1NH2COOH2NH2C NCOOHOH肽的結(jié)構(gòu)與肽鍵肽的結(jié)構(gòu)與肽鍵氨基酸借肽鍵連接的分子叫肽，肽是一大類物質(zhì)，即： 1）兩個氨基酸組成的肽叫二肽；2）三個氨基酸組成的肽叫三肽；3）多個氨基酸組成的肽叫多肽；4）氨基酸借肽鍵連成長鏈，稱為肽鏈，肽鏈兩端有 自由-NH2和-COOH，自由-NH2端稱為N-末端（氨基末端）， 自由-COOH端稱為C-末端（羧基末端）；5）構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基

3、酸殘基；6）肽鏈中的氨基酸的排列順序，一般-NH2端開始，由N指 向C，即多肽鏈有方向性，N端為頭，C端為尾。二、肽的定義與結(jié)構(gòu) 氨基酸借肽鍵連接的分子叫肽，肽是一大類物質(zhì)，即： 1）兩個氨單位小分子 N-C-C-N-C-C-N-C-C-碳為中心 N-C-C-N-C-C-N-C-C兩端氨基酸 N-C-C-N-C-C-N-C-C肽鍵的定位 N-C-C-N-C-C-N-C-C肽的結(jié)構(gòu)分析Juang RH (2004) BCbasics單位小分子 N-C-C-N-C-C-N-C-C-碳為中心肽的書寫寫法：從左右，從N末端C末端。 三字母用連線，也有用單字母的。讀法：酰酰 酸。寫法： Ser-Gly-

4、Try-Ala-Leu 或SGTAL，名稱：絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸肽的書寫寫法：從左右，從N末端C末端。寫法： Ser-Gp 軌道電子共振使肽鍵具雙鍵特性 HCCNCO-+p 軌道電子共振使肽鍵具雙鍵特性 HCCNCO-+NCCHNC 肽鍵 雖是單鍵卻有雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)O 肽鍵 周圍六個原子在同一平面（酰氨平面）上 相鄰兩個氨基酸的 -carbon 在對角 (trans)，反式C肽鍵的特點sp2sp2 肽鍵亞氨基在pH 0-14內(nèi)不解離。NCCHNC 肽鍵 雖是單鍵卻有雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)Pro形成的肽鏈肽平面是可以反式也可以順式。Pro形成的肽鏈肽平面是可以反式也可以

5、順式。兩肽鍵 平面的交接點為 a-碳以肽鍵平面連接成多肽長鏈注意 a-碳上面接有各種大小不等的基團Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.136兩肽鍵 平面的交接點為 a-碳以肽鍵平面連接成多肽長鏈注意 多肽鏈可以看成由Ca串聯(lián)起來的數(shù)個酰胺平面組成氨基酸殘基氨基酸殘基多肽鏈可以看成由Ca串聯(lián)起來的數(shù)個酰胺平面組成氨基酸殘基氨基1、 旋光性一般短肽的旋光度等于其各個氨基酸的旋光度的總和。2、 肽的酸堿性質(zhì)短肽在晶體和水溶液中是以偶極離子形式存在。肽的酸堿性質(zhì)主要取決于N端a-NH和C端a-COOH以及側(cè)鏈R上可解離的基團。在長肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團

6、主要是側(cè)鏈基團。 三、肽的物理化學性質(zhì)1、 旋光性三、肽的物理化學性質(zhì)pH 優(yōu)勢離子的凈電荷： 10.2 -2等電點：3、肽的等電點：pH 優(yōu)勢離子的凈電荷：等電點：3、肽的等電點：肽的a-羧基，a-氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)NH2-CO-NH-CO-NH2 (雙縮脲），能與CuSO4-NaOH產(chǎn)生顏色反應(yīng)。凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，可用于定量分析。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無此反應(yīng)。4、肽的化學反應(yīng)肽的a-羧基，a-氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團都能發(fā)生與游離氨1、 谷胱甘肽（GSH） 三肽（Glu-Cys-Gly），廣

7、泛存在于生物細胞中，含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。四、天然存在的活性肽GluCysGlyg-肽鍵1、 谷胱甘肽（GSH）四、天然存在的活性肽GluCysabgabg2.促甲狀腺素釋放激素：三肽（焦谷氨酰組氨酰脯氨酸），可促進甲狀腺素的釋放。 3.短桿菌素S：環(huán)十肽，含有D-苯丙氨酸、鳥氨酸，對革蘭氏陰性細菌有破壞作用，主要作用于細胞膜。 4.青霉素：含有D半胱氨酸和D纈氨酸的二肽衍生物 。主要破壞細菌的細胞壁粘肽的合成引起溶菌。 2.促甲狀腺素釋放激素：三肽（焦谷氨酰組氨酰脯氨酸），可促進5.牛催產(chǎn)素與加壓素

8、：均為九肽7.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用。6.舒緩激肽：促進血管舒張，促進水、鈉離子的排出。5.牛催產(chǎn)素與加壓素：均為九肽7.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作腦啡與其受體結(jié)合后可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果麻啡可以模擬腦啡的作用，因此有類似的效用腦啡與其受體結(jié)合后可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果麻啡可以模擬腦啡的作用，因H3N+ CH C N CH C O CH3COO-CH2OOCH2HL-Aspartyl-L-phenylalanine methyl esterAspartame阿斯巴甜甜度是蔗糖的180倍 H3N+ CH C N CH C O 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)The structure of proteins一、蛋白

9、質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)氨基酸四級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)一蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)氨基酸四三二一級結(jié)構(gòu)（共價結(jié)構(gòu)）：蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序。一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（初級結(jié)構(gòu)）Primary structure（一）、一級結(jié)構(gòu)的研究內(nèi)容與研究意義研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)，主要研究內(nèi)容：1、氨基酸是如何連接成蛋白質(zhì)，2、對于一定的蛋白質(zhì),氨基酸的排列順序。3、蛋白質(zhì)r的一級結(jié)構(gòu)測定過程。一級結(jié)構(gòu)（共價結(jié)構(gòu)）：一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（初級結(jié)構(gòu)）（一）、意 義：1、研究蛋白

10、質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)，這是因為Pr的一級結(jié)構(gòu)決定了它的高級結(jié)構(gòu)，從而決定了蛋白質(zhì)的生物功能。2、一級結(jié)構(gòu)的研究為生物進化提供了依據(jù)， 不同生物的同一種蛋白的其一級結(jié)構(gòu)是不同的。3、一級結(jié)構(gòu)的研究為一些分子病的診斷提供了依據(jù)。 只有將蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)研究清楚后，生化工作者才能站到一個優(yōu)越的地位去洞察，研究生命過程中的許多復雜問題。意 義：F. Sanger (1951, Cambridge U) Insulin 胰島素 (A, B chains)Nelson & Cox (2000) Principles of Biochemistry (3e) p.142SSSSSS+NH

11、3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-chain（二）、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定F. SangerNelson & Cox (2000) P階段一：測序前的準備工作1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定程序(1).確定蛋白質(zhì)不同多肽鏈的數(shù)目 (2).拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈，打開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵(3).分離純化各自不同的多肽鏈(4).確定各多肽鏈的氨基酸組成分離提純蛋白質(zhì)，測定蛋白質(zhì)的分子量階段一：測序前的準備工作1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定程序(1).階段二：多肽鏈的測序1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定程序(

12、1).特異性打斷多肽鏈，產(chǎn)生適合測序大小的肽段(2).分離純化肽段(3).確定每一肽段的氨基酸順序(4).采用另一種特異性試劑將多肽鏈打斷,重復前三步.階段二：多肽鏈的測序1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定程序(1).特異階段三：氨基酸順序的拼接1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定程序(1).利用重疊拼接法拼接氨基酸順序(2).確定多肽鏈之內(nèi)和之間的二硫鍵的位置. SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-chain+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-F

13、SFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-chainCOO-FLYLVCGERGFYTPKTNH3+SFVNQHLCGHLVEA B-chain階段三：氨基酸順序的拼接1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定程序(1).N-末端分析 A.化學法DNS-Cl法：最常用，黃色熒光，靈敏度極高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。 DNFB法：Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機溶劑（乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等。PITC法：Edman法，逐步切下。無色PTH-氨基酸，有機溶劑抽提，層析。 2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的

14、的鑒定N-末端分析2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定N-末端分析 B.酶 法（氨肽酶法） 從多肽鏈的N-末端逐個地向里切。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和殘基釋放量作動力學曲線。亮氨酸氨肽酶：最常用氨肽酶M：較常用2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定Gly-Ser-ValN-末端分析2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定Gly-N-末端分析 C.常見問題及處理方法：2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定 經(jīng)常碰到N-末端殘基的氨基被封閉。因此不能與Edman降解試劑發(fā)生作用。 焦谷氨酰化、乙酰化以及某些環(huán)狀肽。焦谷氨酸氨肽酶N-末端分析2、N-末

15、端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定 C-末端分析 A.肼解法 無水肼NH2NH2 100 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游離氨基酸留在上清中。 Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定 C-末端分析2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定 C-末端分析 B.還原法, 硼氫化鋰(LiBH4)肽-COOH生成肽-CH2OH水解,分離,層析鑒定。此法比較少用。 C.羧肽酶法，（Pro不能測）2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、LysValSerGly C-末端分析2、N-

16、末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定羧肽 .多肽鏈之間的連接方式 A.共價鍵二硫鍵 -S-S-酰胺鍵 -CO-NH- 酯鍵 -CO-O- B.非共價鍵氫鍵 RH離子鍵 R+R-疏水作用 R R范德華力 R R3、肽鏈的分離、純化與測定 .多肽鏈之間的連接方式3、肽鏈的分離、純化與測共價鍵或非共價鍵的鍵能鍵 長 真空中 水溶液共價鍵離子鍵氫 鍵范德華力0.15 nm 0.25 nm0.30 nm0.35 nm90 80 4 0.190 3 1 0.1kcal/mole共價鍵或非共價鍵的鍵能鍵 長 真空中 水溶 .肽鏈的拆離方法 A.二硫鍵的拆離過甲酸氧化法和巰基化合物（巰基乙醇）還原法。 B.非共價

17、鍵的拆離8M 尿素或6M 鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，多肽鏈松散而成無規(guī)則的構(gòu)象。 C.烷基化試劑保護 如碘乙酸保護還原-SH，防止重新氧化。3、肽鏈的分離、純化與測定 .肽鏈的拆離方法3、肽鏈的分離、純化與測定蛋白質(zhì)-醫(yī)學知識課件4、肽鏈的部分水解 拆鏈得到的多肽鏈一般是100-1000個氨基酸，需要將其切成小肽段，分別測定它們的順序，最后連在一起。1、裂解的部位要專一。2、裂解點要少，切的肽段的大小要合適。3、產(chǎn)率要高，要求試劑不能破壞裂解后的肽段。裂解的方法：化學法，酶學法4、肽鏈的部分水解 拆鏈得到的多肽鏈一般是100、化學裂解法 A.溴化氰裂法：專一裂解Met羧基所成的肽鍵4、肽鏈的部分水解

18、、化學裂解法4、肽鏈的部分水解甲基硫氰酸甲基硫氰酸、化學裂解法 B.羥胺斷裂：專一裂解Asn-Gly之間的肽鍵。4、肽鏈的部分水解專一不很強，Asn-Leu,Asn-Ala鍵也部分裂解由于Asn-Gly出現(xiàn)機率較低，所以所得片斷較大。、化學裂解法4、肽鏈的部分水解專一不很強，Asn-Leu,、酶裂解法 A.胰蛋白酶( trypsin )4、肽鏈的部分水解專一裂解Lys、Arg的羧基參與形成的肽鍵。為了減少的作用位點，可用化學修飾將多肽鏈側(cè)鏈保護起來，1.2環(huán)己酮封閉Arg，馬來酸酐封閉Lys。氮丙啶形成帶正電荷點，增加位點。B.糜蛋白酶(Chymotrypsin)斷裂Phe,Trp,Tyr等疏

19、水AA的羧基所形成的肽鍵。斷裂鍵鄰近的基團，堿性：裂解能力，酸性：裂解能力、酶裂解法4、肽鏈的部分水解專一裂解Lys、Arg的羧基參環(huán)已二酮環(huán)已二酮、酶裂解法 C.胃蛋白酶(Pepsin)4、肽鏈的部分水解斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性或芳香氨基酸殘基。其后和前為Pro時抑制。D.嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)疏水、芳香氨基酸殘基氨基端，含Ca，Zn。 Phe, Trp, Tyr, Leu, Ile, Val, Met ，羧基是Pro, Gly時不作用。、酶裂解法4、肽鏈的部分水解斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性或芳、酶裂解法 .金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶），4、肽鏈的部分水解 磷酸緩沖

20、液PH7.8能在Glu殘基和Asn殘基的羧基側(cè)斷裂肽鍵，NH4HCO3緩沖液pH7.8醋酸銨緩沖液PH4.0只能斷裂Glu殘基的羧基側(cè)肽鍵.梭狀芽孢桿菌蛋白酶（Arg蛋白酶） 專門裂解Arg殘基的COOH所形成的肽鍵,對不溶性蛋白質(zhì)的長時間裂解很有效。、酶裂解法4、肽鏈的部分水解 磷酸緩沖液PH7.8能胰蛋白酶 Lys X, Arg X (X Pro) 胰凝乳蛋白酶 TyrX，TrpX, PheX (X Pro) 胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)Phe(Trp、 Try、 Leu)嗜熱菌蛋白酶 X-Phe, Trp, Tyr, Leu, Ile, Val, Met （ Pro）G

21、lu蛋白酶 GluXArg蛋白酶 ArgX酶法裂解總結(jié)胰蛋白酶 酶法裂解總結(jié)電泳法：SDS 根據(jù)分子量大小分離離子交換層析法:（DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex） 根據(jù)肽段的電荷特性分離反相HPLC法 根據(jù)肽段的極性分離凝膠過濾要求： SDSPAGE單帶 HPLC單峰 N端單一（常用DNSCl法）5、肽段的分離純化電泳法：SDS、肽段的分離純化1）、Edman法 （1）耦聯(lián) PITC HNA-B-C-D pH9，40 PTCA-B-C-D6、肽段序列測定及肽鏈的拼接1）、Edman法 6、肽段序列測定（2）裂解 無水三氟乙酸（CF3COOH）ATZA + H2NB-C-

22、DCF3COOH ATZ6、肽段序列測定及肽鏈的拼接（2）裂解CF3COOH ATZ6、肽段序列測定及肽鏈的拼接（3）轉(zhuǎn)化（ATZ不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化成PTH-aa) ATZPTHaa PTC肽：苯氨基硫甲酰肽; ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）; PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸） ATZPTC-aaPTH-aaH2O(1M HCl)6、肽段序列測定及肽鏈的拼接（3）轉(zhuǎn)化（ATZ不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化成PTH-aa) ATZPTC2）、用自動序列分析儀測序儀器原理：Edman法。1967液相測序儀：旋反應(yīng)器，適于大肽段。1971固相測序儀：表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的端。1981氣相測序儀：用Pol

23、ybrene反應(yīng)器。6、肽段序列測定及肽鏈的拼接2）、用自動序列分析儀測序6、肽段序列測定及肽鏈的拼接蛋白質(zhì)-醫(yī)學知識課件3）、肽段拼接成肽鏈16肽，端H 端 法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT6、肽段序列測定及肽鏈的拼接法裂解：SEO WTON VERL APS HO重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS3）、肽段拼接成肽鏈6、肽段序列測定及肽鏈的拼接法裂解：S一條多肽鏈經(jīng)兩種部分水解的方法得到兩套肽段，經(jīng)測定各肽段的氨基酸順

24、序都已確定，推知整條肽鏈的氨基酸順序。1).溴化氰裂解后的肽段(1).Trp-Ser-Arg-Glu-Hsr(2).Gly-His-Ala-Leu-Lys-Phe-Glu(3).Ala-Gly-Val-Lys-Asp-Hsr(4).Pro-Val-Lys-Ile-Phe-Hsr2).胰蛋白酶裂解后的肽段(1).Ile-Phe-Met-Trp-Ser-Arg(2).Ala-Gly-Val-Lys(3).Asp-Met-Pro-Val-Lys(4).Glu-Met-Gly-His-Ala-Leu-Lys(5).Phe-Glu(3)-(4)-(1)-(2)(2)-(3)-(1)-(4)-(5)一條多

25、肽鏈經(jīng)兩種部分水解的方法得到兩套肽段，經(jīng)測定各肽段的氨根據(jù)以下實驗結(jié)果,推斷一條多肽鏈的氨基酸順序.1).酸水解得知氨基酸的組成:2Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;2Ser.2).羧肽酶A水解得:Ala.3).胰蛋白酶水解得四肽段,其氨基酸組成如下:(1).Ala;Arg. (2).Lys;Phe;Ser.(3).Lys. (4).Ala;Met;Ser.4).溴化氰裂解得兩個肽段,其氨基酸組成如下:(1).Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;Ser. (2).Ala;Ser.5).嗜熱菌蛋白酶水解得兩個肽段,其氨基酸組成如下:(1).Ala;Arg;Ser. (2).Ala;2Lys;Met;Phe;Ser. Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala根據(jù)以下實驗結(jié)果,推斷一條多肽鏈的氨基酸順序.Ala-Arg蛋白質(zhì)-醫(yī)學知識課件測核酸序列推斷氨基酸序列1）酶降解法測序2）質(zhì)譜法測定（蛋白質(zhì)組）p177書3）根據(jù)核苷酸序列的推定法7、其它測序方法測核酸序列推斷氨基酸序列1）酶降解法測序7、其它測序方法氣質(zhì)聯(lián)用液質(zhì)聯(lián)用氣質(zhì)聯(lián)用液質(zhì)聯(lián)用 對角線電泳法胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì)；第一向電泳；過甲酸氧化SS生成-SO3-后；第二向電泳；分離出含二硫鍵的兩條短肽，測序與拼接出的肽鏈比較，定出