我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析培訓(xùn)課件

1、我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析【摘要】目的 測定我國人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白G 基因序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。方法RT-PCR 擴(kuò)增3 株病毒糖蛋白G 基因，分別克隆至pGEM-T 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，篩選陽性克隆，進(jìn)行測序。應(yīng)用DNAstar MegAlign 軟件分析3 株病毒糖蛋白的同源性，AntheProt 5. 0 及DNAstar Protean 軟件分析3 株病毒糖蛋白的結(jié)構(gòu)及潛在B 細(xì)胞抗原表位的差異。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析2【摘要】目的 測

2、定我國人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的人獸共患疾病，一旦發(fā)病，幾乎100死亡，疫苗接種是預(yù)防該病的重要措施。目前，我國人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒株主要有aG、CTN-1V 和PV2061 株，其中aG 株和CTN-1V 株為我國自行分離并傳代適應(yīng)，PV2061 株來源于法國巴斯德株。上述病毒株生產(chǎn)的人用狂犬病疫苗經(jīng)臨床應(yīng)用顯示，具有良好的保護(hù)效果。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析3狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的 我國人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用原始種子4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白（G

3、lycoprotein，G）全基因序列進(jìn)行測定，分析3 株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析4 我國人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用原始種子4aGV、CTN-1V1. 材料與方法 1. 1 菌毒株 狂犬病病毒原始種子批4aGV、CTN-1V 和PV2061均由中國食品藥品檢定研究院病毒一室保存；感受態(tài)大腸桿菌DH5。 1. 2 主要試劑 QIAamp Viral RNA Mini Kit Reverse Transcription System TaKaRa LA Taq誖DRR002A EZNA誖Gel Extraction Kit pGEM-T vector sy

4、stem 我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析51. 材料與方法 1. 1 菌毒株我國人用狂犬病疫苗株病毒1. 3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的aG、CTN、PV 株病毒M、L 區(qū)基因序列，應(yīng)用Primer Premier5. 0 軟件設(shè)計(jì)位于M 區(qū)及L 區(qū)的上下游引物，見表1。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析61. 3 引物設(shè)計(jì)及合成我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析7我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析71. 4 病毒G 區(qū)基因的擴(kuò)增 用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒RN

5、A， Reverse Transcription System 提供的隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄 合成cDNA 第一鏈，再以其為模板，PCR 擴(kuò)增目的基因。 反應(yīng)體系為：c DNA 2 l，10 buffer 5 l， 2. 5 mmol L dNTP 4 l，上下游引物各2 l（10 pmol L），LA Taq 1 l，去離子水補(bǔ)足體積至50 l。反應(yīng)條件為：95預(yù)變性5 min；95 30 s，53 30 s，72 2 min，共30個循環(huán)；72再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1瓊脂糖 凝膠電泳鑒定，EZNA誖Gel Extraction Kit 純化回收。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析

6、81. 4 病毒G 區(qū)基因的擴(kuò)增 用QIAamp Vir1. 5 克隆測序 將PCR 純化產(chǎn)物與pGEM-T vector 連接，轉(zhuǎn)化 感受態(tài)大腸桿菌DH5，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR 鑒定后，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序，每個片段至少送6 個陽性克隆。1. 6 病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析 應(yīng)用DNAstar 中的MegAlign 軟件分析3 株病 毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列的同源性；應(yīng)用 AntheProt 5. 0 及DNAstar 中的Protean 軟件分析3株病毒糖蛋白的結(jié)構(gòu)及潛在B 細(xì)胞抗原表位的差 異。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析91. 5 克隆測序我

7、國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分2. 結(jié)果2. 1 病毒G 區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定應(yīng)用配對引物分別擴(kuò)增4aGV、CTN-1V 和PV2061株病毒G 區(qū)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約2 300 bp 的特異條帶，大小與預(yù)期相符；應(yīng)用3 對引物分別擴(kuò)增4aGV、CTN-1V 和PV2061株病毒G 區(qū)基因，僅配對引物擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。盡管應(yīng)用aG-MGL-F R 引物對PV2061 株病毒G 區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增時有條帶出現(xiàn)，但該條帶大小及擴(kuò)增產(chǎn)物濃度均與目的片段明顯不符，為非特異性擴(kuò)增。因此3 對引物均具有特異性，與其他毒株無特異性配對。見圖1。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物

8、信息學(xué)分析102. 結(jié)果2. 1 病毒G 區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定我國人用狂犬圖1 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析11圖1 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒2. 2 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒糖蛋白基因序列同源性分析4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白測序結(jié)果已提交到GenBank，登錄號分別為JN234411、JN234418 和JN234424。測序結(jié)果表明，3 株病毒均為基因型狂犬病病毒；其基因組M-G 區(qū)間序列長度均為5 bp，CTN-1V 株M-G 區(qū)間序列為C

9、TTTT，4aGV 與PV2061 株為CTATT；3 株病毒G 區(qū)全序列均具有5端AACA 和3端polyA 尾結(jié)構(gòu)，其中CTN-1V、4aGV 株G 區(qū)基因長度為2 067 bp，PV2061 株為1 675 bp，基因同源性為76. 0 88. 4；3 株病毒G 區(qū)ORF 基因均為1 575 bp，基因同源性為84. 4 91. 5；CTN-1V、4aGV 株G-L 區(qū)間序列長度為24 bp，PV2061 株為423 bp。對推導(dǎo)的3 株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性分析表明，3株病毒糖蛋白均由524 個氨基酸組成，同源性為90. 5 92. 2，見表2。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物

10、信息學(xué)分析122. 2 4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析培訓(xùn)課件2. 3 糖蛋白信號肽分析 對4aGV、CTN-1V 和PV2061 株的糖蛋白信號肽分析發(fā)現(xiàn)，三者前19 位氨基酸均存在潛在信號肽結(jié)構(gòu)，其中第19 位氨基酸為三者潛在信號肽斷裂位點(diǎn)，4aGV 株病毒糖蛋白第17 位氨基酸為潛在信號肽斷裂位點(diǎn)，見圖2。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析142. 3 糖蛋白信號肽分析 我國人用狂犬病我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析15我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析152. 4 糖蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析對4aGV、

11、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行跨膜區(qū)域分析，結(jié)果顯示，3 株病毒糖蛋白分別在第463 476、464 475 及463 475位氨基酸存在潛在可折疊螺旋的疏水性區(qū)域，可判斷為明顯跨膜區(qū)域，見圖3。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析162. 4 糖蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析對4aGV、CTN-1V 和P圖3 4aGV（A）、CTN-1V（B）和PV2061 株（C）糖蛋白潛在跨膜區(qū)域預(yù)測我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析17圖3 4aGV（A）、CTN-1V（B）和PV20612. 5 糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用AntheProt5. 0 軟件中的Gibra

12、t 法對4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，4aGV、CTN-1V 和PV2061 株糖蛋白氨基酸殘基均富含潛在 螺旋、 折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，其比例分別為30、31、39，28、30、41和29、30、41，3 株病毒糖蛋白發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高，易形成豐富的二級結(jié)構(gòu)，見圖4。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析182. 5 糖蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析19我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析192. 6 糖蛋白B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)合4aGV、CTN-1V 和PV206

13、1 株病毒糖蛋白一級、二級及局部特殊結(jié)構(gòu)，選取各株病毒糖蛋白親水性強(qiáng)，無 螺旋、 片層規(guī)則結(jié)構(gòu)，并具有 轉(zhuǎn)角的可塑性較大區(qū)域及表面可能性和抗原指數(shù)高的區(qū)域，分別得到3 株病毒株糖蛋白潛在B 細(xì)胞抗原表位區(qū)域，三者表位位置與數(shù)量相似，見圖5 和表3。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析202. 6 糖蛋白B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測我國人用狂犬病疫苗株病毒我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析21我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析21我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析22我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析22信號肽結(jié)構(gòu)常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移（

14、定位）的N-末端氨基酸序列，其至少含有1 個帶正電荷的氨基酸，中部有一高度疏水區(qū)以通過細(xì)胞膜，并具有種屬特異性。4aGV、CTN-1V、PV2061 株病毒在N-末端前19 位氨基酸均存在潛在信號肽結(jié)構(gòu)，可引導(dǎo)病毒糖蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)。此外，3 株病毒潛在信號肽結(jié)構(gòu)氨基酸同源性僅為78. 9 94. 7，這可能是在傳代減毒過程中，病毒對不同傳代基質(zhì)細(xì)胞的適應(yīng)表征，反過來也間接影響了3 株病毒在Vero 細(xì)胞中的適應(yīng)程度。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析23信號肽結(jié)構(gòu)常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白我國人用狂犬病疫苗株Benmansour 等11通過對中和單克隆抗體逃逸株點(diǎn)突變的研究，

15、對糖蛋白的中和抗原位點(diǎn)進(jìn)行了初步定位，證明了糖蛋白含有3 個中和抗原位點(diǎn)，且均為空間依賴型抗原位點(diǎn)，但目前仍缺乏病毒糖蛋白線性表位的研究資料，因此本研究對4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入分析，結(jié)果顯示，3株病毒糖蛋白均易發(fā)生扭曲、折疊，在多個區(qū)域存在 螺旋、 折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，形成豐富的二級結(jié)構(gòu)，并在多個位點(diǎn)存在潛在B 細(xì)胞抗原位點(diǎn)。盡管目前尚無準(zhǔn)確率較高的抗原位點(diǎn)預(yù)測方法，但本研究的分析結(jié)果仍可作為確定糖蛋白潛在優(yōu)勢表位的參考。此外，本研究應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增不同株病毒糖蛋白全基因，并結(jié)合相應(yīng)糖蛋白編碼區(qū)序列的同源性分析，可初步實(shí)現(xiàn)病毒株的快速鑒定。我國人用

16、狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析24Benmansour 等11通過對中和單克隆抗體逃逸株點(diǎn)研究結(jié)果4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒均屬基因型狂犬病病毒；其糖蛋白G 區(qū)基因同源性為76. 0 88. 4，G 區(qū)ORF 基因同源性為84. 4 91. 5，氨基酸序列同源性為90. 5 92. 2；3 株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潛在信號肽結(jié)構(gòu)，其中第19 位氨基酸為三者潛在信號肽斷裂位點(diǎn)，第17 位氨基酸為4aGV 株病毒糖蛋白潛在信號肽斷裂位點(diǎn)；3 株病毒糖蛋白分別在第463 476、464 475 及463 475 位氨基酸存在潛在可折疊螺旋的疏水性區(qū)域，為明顯跨膜區(qū)域； 4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒糖蛋白氨基酸殘基均富含潛在 螺旋、 折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，其比例分別為30、31、39，28、30、41和29、30、41，易發(fā)生扭曲、折疊，形成豐富的二級結(jié)構(gòu)； 3 株病毒糖蛋白潛在B 細(xì)胞抗原表位位置與數(shù)量相似我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析25研究結(jié)果4aGV、CTN-1V 和PV2061 株病毒均屬基 糖蛋白具有決定病毒毒力的關(guān)鍵位點(diǎn)，是狂犬病病毒中唯一能誘生宿主產(chǎn)生中和抗體的抗原成分，也能有效刺激T 淋