基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)培訓(xùn)課件

1、基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)1995年，康乃爾大學(xué)的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中的par-1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。她們本是利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義RNA（sense RNA）以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反的。該研究小組一直沒能給這個(gè)意外以合理解釋。直到1998年2月，華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire和馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Craig Mello才首次揭開這個(gè)懸疑之謎。通過(guò)大量艱

2、苦的工作，他們證實(shí)，Su Guo博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過(guò)去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過(guò)純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNA interference ,簡(jiǎn)稱RNAi)。在隨后的短短一年中，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在

3、被逐步闡明，而同時(shí)作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來(lái)越為人們所重視?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)21995年，康乃爾大學(xué)的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿2000年，RNA的研究進(jìn)展被美國(guó)科學(xué)雜志評(píng)為重大科技突破；2001年“RNA干擾”作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”；2002年12月20日，Science雜志將“Small RNA & RNAi”評(píng)為2002年度最耀眼的明星。同時(shí)， Nature雜志亦將Small RNA評(píng)為年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近

4、20年來(lái)，可與HGP（人類基因組計(jì)劃，生物通網(wǎng)站注）相提并論的最重大成果之一。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)32000年，RNA的研究進(jìn)展被美國(guó)科學(xué)雜志評(píng)為重大科技突三、基因干預(yù) Gene Interference基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)4三、基因干預(yù) Gene Interference基因治療醫(yī)學(xué)基因干預(yù)的種類：1.反義RNA (antisense RNA)2.干擾RNA (RNA interference)3.核酶 (ribozyme)基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)5基因干預(yù)的種類：1.反義RNA (antisense RNA反義RNA: 與靶核酸（如mRNA或有義DNA）鏈互補(bǔ)的RNA分子，可抑制核酸的功能反

5、義RNA，根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類：類反義RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶 降解；類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)6反義RNA: 與靶核酸（如mRNA或有義DNA）鏈互補(bǔ)的RN （一）反義RNA 1. 反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控 利用反義RNA對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。 （2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義R

6、NA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)7 （一）反義RNA基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn) 反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題：反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問(wèn)題專一性轉(zhuǎn)移問(wèn)題： 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)8 反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題：反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞2.受體介導(dǎo)反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù) 受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層, 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。 將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價(jià)連接，得到ASGP-PL復(fù)合物，成為運(yùn)載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝

7、細(xì)胞表面的ASGP受體所識(shí)別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來(lái)發(fā)揮作用。 借助受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA的轉(zhuǎn)移?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)92.受體介導(dǎo)反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù) 受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分 3. 反義RNA的應(yīng)用前景 受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。 （l）安全性高 （2）反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便 （3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng) （4）能直接作用于一些RNA病毒 反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。反義RNA分子無(wú)論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，

8、不留“殘?jiān)薄?在治療RNA病毒感染性疾病時(shí)，受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢(shì)。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)10 3. 反義RNA的應(yīng)用前景 受體介導(dǎo)的反義RNA（二）干擾RNA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有義鏈RNA（sense RNA）或反義鏈RNA（antisense RNA）均能抑制線蟲基因的表達(dá)，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達(dá)。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達(dá)途徑。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率

9、比反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。1.RNA干擾現(xiàn)象 RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過(guò)程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。 對(duì)RNA干擾的認(rèn)識(shí)來(lái)源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。/nrg/journal/v2/n2/animation/nrg0201_110a_swf_MEDIA1.html/RNAi.htm基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)11（二）干擾RNA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有義鏈RNA（se 2.RNA干擾的機(jī)制 RNA干擾過(guò)程主要有2個(gè)步驟： （1）小干擾性RNA（siR

10、NA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。 該復(fù)合體可識(shí)別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。 長(zhǎng)雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)12 2.RNA干擾的機(jī)制RNA干擾過(guò)程主要有2個(gè)步驟：（1）小A. 賈第鞭毛蟲Dicer的晶體結(jié)構(gòu)； RNA干擾機(jī)制示意圖 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)13A. 賈第鞭毛蟲

11、Dicer的晶體結(jié)構(gòu)； RNA干擾機(jī)制示意圖 1. 體外化學(xué)合成; 2. 用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA的產(chǎn)生基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)14 1. 體外化學(xué)合成; 2. 用3.RNA干擾的應(yīng)用前景 RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展，使其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)153.RNA干擾的應(yīng)用前景基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)15（1） 研究基因功能的新工具 由于 RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具

12、。 RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型；抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)16（1） 研究基因功能的新工具 由于 RNA干擾技 （2） 腫瘤的基因治療 傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)，而RNA干擾技術(shù)可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表型，也可以同時(shí)使用多種雙鏈RNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異?；虮磉_(dá)的惡性腫瘤。

13、K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病有關(guān)，用RNA干擾技術(shù)可以阻礙K-RAS蛋白的表達(dá)從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細(xì)胞系。 通過(guò)RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進(jìn)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對(duì)化療藥物的反應(yīng)性。 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功地阻斷了MCF-7乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp1的功能。“沉默”真的是金 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)17 （2） 腫瘤的基因治療 傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘 （3） 病毒性疾病的基因治療 RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）

14、某些基因的表達(dá)，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用RNA干擾技術(shù)抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可阻礙HIV感染細(xì)胞。也可通過(guò)RNA干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等?！俺聊闭娴氖墙?基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)18 （3） 病毒性疾病的基因治療 “沉默”真的是金 基 siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對(duì)病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對(duì)于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大

15、的意義。基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)19 siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑siRNA的輸送（siRNA delivery)基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)20siRNA的輸送（siRNA delivery)基因治療醫(yī)學(xué)siRNA的輸送（siRNA delivery)基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)21siRNA的輸送（siRNA delivery)基因治療醫(yī)學(xué)T. Cech S. Altman 1989年，核酶的發(fā)現(xiàn)者T.Cech和S. Altman被授予 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 （三）核酶(ribozyme) 核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)22T. Cech S. Altman 1

16、989年，核酶的發(fā)現(xiàn)者（三）核酶(ribozyme) 天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由兩個(gè)RNA分子組成。 在基因治療時(shí)，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)泥徫?，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過(guò)破壞靶RNA分子達(dá)到治療疾?。ㄈ缜宄《净蚪MRNA）的目的。 只要兩個(gè)RNA分子通過(guò)互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（3個(gè)螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個(gè)或11個(gè)保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)23（三）核酶(ribozyme) 天然核酶多為 1. 核酶的設(shè)計(jì) 核酶是通過(guò)靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)

17、構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個(gè)方面來(lái)設(shè)計(jì)核酶。 （1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點(diǎn)，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。 （2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。 在基因治療中，主要是根據(jù)治療的靶基因序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)和合成特定的核酶。設(shè)計(jì)的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)24 1. 核酶的設(shè)計(jì) 核酶是通過(guò)靶RNA分子與核酶分核酶的作用機(jī)制 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)25核酶的作用機(jī)制 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)25 2.核酶的應(yīng)用 與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)

18、構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來(lái)，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)26 2.核酶的應(yīng)用 與一般的反義RNA相比，核四、治療基因的受控表達(dá) Regulated Expression of Therapeutic Gene基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)27四、治療基因的受控表達(dá) Regulated Expressi 時(shí)間: 要實(shí)現(xiàn)治療基因的受控表達(dá)，必須建立完善的基因表達(dá)調(diào)控體系?；蛘{(diào)控策略大致有以下幾種：基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制、基因外部調(diào)節(jié)機(jī)制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)以及治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)等。 治療基因的受控表達(dá)包括控制治

19、療基因表達(dá)的時(shí)間、空間和水平三個(gè)方面。 空間:表達(dá)水平：希望治療基因能在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)。 1.控制治療的基因在患者需要實(shí)施治療時(shí)才表達(dá)，而平時(shí)不需要進(jìn)行治療時(shí)則處于關(guān)閉狀態(tài)； 2.根據(jù)不同疾病的治療要求，控制治療基因持續(xù)表達(dá)的時(shí)間跨度。 是指為了提高基因治療的專一性和安全性，嚴(yán)格限制治療基因只在靶細(xì)胞中表達(dá)，避免治療基因指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)干擾非靶細(xì)胞的正常生活，產(chǎn)生毒副作用。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)28 時(shí)間: 要實(shí)現(xiàn)治療基因的受控表達(dá)，必須建立（一）基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)29（一）基因內(nèi)部的調(diào)

20、節(jié)機(jī)制基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)29 1.使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件 例如，酪氨酸酶是皮膚細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生色素途徑中的一種酶，可利用其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因只在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)，而不在正常的周邊細(xì)胞中表達(dá)。 不同類型的正常細(xì)胞或組織中往往存在某些特有的蛋白質(zhì)，它們的基因表達(dá)調(diào)控元件可用于驅(qū)動(dòng)治療基因的特異性表達(dá)，從而起到治療作用。 前列腺特異性抗原(PSA)是參與精液凝塊中蛋白質(zhì)降解、使精液液化的一種絲氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中產(chǎn)生，而在前列腺癌細(xì)胞中含量很高，可以利用PSA基因調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)治療基因在PSA陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)而發(fā)揮作用，而其在PSA陰性細(xì)胞和非前列腺癌細(xì)胞

21、中不能使治療基因表達(dá)?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)30 1.使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件例如，酪氨酸 2.使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件 某些病變的細(xì)胞或組織產(chǎn)生一些特殊的蛋白質(zhì)，其基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件也可以用來(lái)控制治療基因的特異性表達(dá)。 甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細(xì)胞中表達(dá)，不在成年肝臟細(xì)胞中表達(dá)。肝細(xì)胞腺癌細(xì)胞中AFP基因異常激活，因此可利用該基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因(如自殺基因)在癌細(xì)胞中表達(dá)，使癌細(xì)胞經(jīng)給藥后被殺死。 癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成員，在許多腺癌細(xì)胞中表達(dá)很高，采用其啟動(dòng)子可以使治療基因只在CEA陽(yáng)性的癌細(xì)胞中表達(dá)，而不會(huì)在陰性細(xì)胞中表

22、達(dá)。基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)31 2.使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件 （二）基因外部的調(diào)節(jié)機(jī)制 除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制以外，還可通過(guò)施加外部刺激，促進(jìn)治療基因在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)。 采用熱休克蛋白基因的表達(dá)調(diào)控元件來(lái)啟動(dòng)治療基因，可以通過(guò)對(duì)病灶局部進(jìn)行熱處理，達(dá)到使治療基因特異性表達(dá)的目的。 Egr-1基因是一種編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子的早期基因，包括電離輻射和細(xì)胞因子等在內(nèi)的多種外部刺激都可以誘導(dǎo)其表達(dá)，將其調(diào)控序列啟動(dòng)的治療基因(如腫瘤壞死因子基因)導(dǎo)入腫瘤組織，可在電離輻射等作用下，使治療基因獲得暫時(shí)性的局部表達(dá)，殺死腫瘤細(xì)胞。 組織纖溶酶原激活物(t-PA)作為溶解血栓的藥劑，在中

23、風(fēng)和心肌梗死等疾病治療中起著重要的作用。t-PA的活性在輻射后增加50倍，表明其基因表達(dá)調(diào)控元件中存在受輻射誘導(dǎo)的調(diào)控元件，故可利用其調(diào)控元件啟動(dòng)治療基因的表達(dá)，增強(qiáng)放療效果。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)32（二）基因外部的調(diào)節(jié)機(jī)制 除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá) 病灶微環(huán)境與正常時(shí)往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達(dá)。 例如，在腫瘤病灶處，常常出現(xiàn)葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/Bip的含量也隨之增加，使癌細(xì)胞能夠抵御應(yīng)激。當(dāng)采用這種基因的啟動(dòng)子來(lái)控制治療基因時(shí)，可以使治療基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，使腫瘤組織壞死。 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度快于形成血管的

24、內(nèi)皮細(xì)胞，造成供血不足，因此在腫瘤內(nèi)部形成酸性、缺氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的區(qū)域。缺氧條件可以通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和缺氧響應(yīng)元件(HRE)相互作用，調(diào)節(jié)一些基因的表達(dá)；如果采用缺氧響應(yīng)元件(HRE)來(lái)控制治療基因的表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)治療基因只在缺氧的腫瘤組織中表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)。 機(jī)體發(fā)炎時(shí)所可產(chǎn)生的許多急性期蛋白，其基因的啟動(dòng)子可以控制發(fā)炎條件下治療基因的表達(dá)；而一旦炎癥消失，治療基因的表達(dá)也隨之終止。基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)33（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá) 病灶微（四）治療基因的誘導(dǎo)表達(dá) 采用組織特異性啟動(dòng)子控制治療基因的表達(dá)，可能造成這些基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，不再受外界控制。為了

25、避免這種情況發(fā)生，研究人員正在開發(fā)和完善一些可誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)。 這種系統(tǒng)的必要成分：一種是轉(zhuǎn)錄激活劑，它只在誘導(dǎo)藥物存在時(shí)才能與DNA結(jié)合；另一種則是特異性基因表達(dá)調(diào)控元件，僅對(duì)這種轉(zhuǎn)錄激活劑有所響應(yīng)。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)34（四）治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)34四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受Tet阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控。無(wú)四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)；四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對(duì)四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)35四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理四環(huán)

26、素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受Tet阻遏蛋白五、基因治療的應(yīng)用研究The Application of Gene Therapy基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)36五、基因治療的應(yīng)用研究The Application of 世界上第一個(gè)正式被批準(zhǔn)用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國(guó)Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗(yàn)。基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)37 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)37（一）遺傳病的基因治療研究 已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為4050。但真正了解病因，能進(jìn)行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。

27、 1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞(如皮膚細(xì)胞，骨髓細(xì)胞等)中表達(dá)并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果(如不治療難以存活等)。可供選擇并符合上述4條以上要求的不過(guò)只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)38（一）遺傳病的基因治療研究 已知人類有4000多種1腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏癥 2珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病 3血友病和其他血漿蛋白缺乏癥 4苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病 5萊-納(Les

28、ch-Nyhan)綜合征 6家族性高膽固醇血癥 7囊性纖維化病 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)391腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 基因治療醫(yī)學(xué)知（二）惡性腫瘤基因治療研究 （1）通過(guò)基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移； 腫瘤發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，許多基因的突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過(guò)干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，通過(guò)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解和排斥反應(yīng)；（4）通過(guò)導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細(xì)胞?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)40（二）惡性腫瘤基因治療研究（1）通過(guò)基因置換和基因補(bǔ)充

29、，導(dǎo)入 1.腫瘤基因治療的基本策略 從實(shí)際應(yīng)用于臨床治療的角度來(lái)看，腫瘤基因治療的策略包括： (1)直接殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)。 (2)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞。 (3)改善腫瘤常規(guī)治療方法，提高療效?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)41 1.腫瘤基因治療的基本策略 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)41 2.腫瘤基因治療的常用方法 基因干預(yù)技術(shù)：通過(guò)基因干預(yù)，使得腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。 自殺基因治療分子化療：直接殺死腫瘤細(xì)胞。 腫瘤的免疫基因治療：以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能。 提高化療效果的輔助基因治療： 藥物增敏基因治療； 耐藥基因治療。 基因治療

30、醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)42 2.腫瘤基因治療的常用方法基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)42 3.自殺基因治療：自殺基因治療是目前腫瘤基因治療領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一。 基本原理：向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細(xì)胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達(dá)的特異性酶可以催化對(duì)真核細(xì)胞無(wú)毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的抗代謝藥物，進(jìn)而選擇性地將轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細(xì)胞“自殺”。這些基因也相應(yīng)地被稱為“自殺基因”?；蛑委熱t(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)43 3.自殺基因治療：自殺基因治療是目前腫瘤基因治 自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達(dá)必須局限于腫瘤細(xì)胞中，而不傷及正常細(xì)胞。 利用免疫脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)等技術(shù)進(jìn)行定向基因轉(zhuǎn)移。

31、利用病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄。腫瘤內(nèi)直接注射。 自殺基因轉(zhuǎn)移常用方法基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)44 自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達(dá)必須局基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)培訓(xùn)課件5.提高化療效果的輔助基因治療： 臨床上對(duì)腫瘤患者進(jìn)行化療時(shí)，通常面臨兩大難題：（1）是患者機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感程度存在差異，特別是某些經(jīng)過(guò)多次化療的患者，其體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生交差耐受，最終導(dǎo)致化療失敗。（2）是大劑量的化療可能導(dǎo)致患者的正常細(xì)胞，特別是骨髓造血細(xì)胞的功能受到抑制。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)465.提高化療效果的輔助基因治療： 臨床上對(duì)腫瘤患者進(jìn)行 (

32、1)藥物增敏基因治療： 將雞鈣調(diào)素（calmodulin, CaM）基因?qū)胄∈笕橄侔┘?xì)胞株C127，結(jié)果僅需低劑量的長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春花堿即可明顯抑制該細(xì)胞株的生長(zhǎng)。對(duì)其作用原理進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，CaM基因的表達(dá)產(chǎn)物作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要物質(zhì)，明顯增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春花堿的吸收量而相應(yīng)減少了排出量，從而提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。 為了使化療藥物能夠最大程度地殺死腫瘤細(xì)胞，可以考慮將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，特別是對(duì)化療藥物原本不敏感的腫瘤細(xì)胞，使其對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性大大增加，從而達(dá)到增強(qiáng)化療效果的目的。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)47 (1)藥物增敏基因治療：

33、 將雞鈣調(diào)素（ (2)耐藥基因治療： 在解決化療所致骨髓細(xì)胞造血功能受到嚴(yán)重抑制的問(wèn)題方面，通過(guò)向腫瘤患者的骨髓細(xì)胞導(dǎo)入某種耐藥基因，如mdr-1基因等，以增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的抗藥性，以便耐受大劑量的化療藥物，以達(dá)到徹底殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。 腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生與多種糖蛋白或酶有關(guān)，包括多藥耐藥（mdr-1）基因編碼的P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）以及近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的肺耐藥相關(guān)蛋白等；還有細(xì)胞內(nèi)氧化和解毒作用的酶系統(tǒng)，包括細(xì)胞色素P-450（cytochrome P-450）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）等等。 目前除了開發(fā)針對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的拮抗劑

34、，如用于阻斷P-糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥的戊脈安（verapamil）和用于阻斷GSH合成的丁硫氨酸亞砜胺（BSO）等。還采用基因干擾技術(shù)，在基因水平阻斷耐藥基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞喪失多藥耐藥性，從而易于被化療藥物殺死。 基因治療醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)48 (2)耐藥基因治療： 在解決化（三）病毒性疾病的基因治療研究 據(jù)統(tǒng)計(jì)，75%的人類傳染病是由病毒引起的。病毒感染人體后不僅可能急性發(fā)病，還可以在人體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，造成終身傷害。病毒還是造成先天畸形的重要因素之一。研究表明，它與某些癌癥、自身免疫性疾病和內(nèi)分泌疾病也存在一定的聯(lián)系。迄今為止，臨床上對(duì)絕大多數(shù)病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治療手段，而在眾多開展的抗病毒治療方案中，抗病毒基因治療十分引人注目。