組織病理學(xué)制片技術(shù)-課件

1、Notice1.上課請關(guān)手機(jī)（或調(diào)成振動，接電話到室外）。2. 選修課自愿選擇，試聽一次，下次課班長提交選修課學(xué)生名單(包括email)。3. 學(xué)分問題 平時表現(xiàn) 如：紀(jì)律、問答、作業(yè)。 結(jié)課測驗? 對本課程的意見和建議；1ppt課件Notice1.上課請關(guān)手機(jī)（或調(diào)成振動，接電話到室外）。1組織病理學(xué)制片技術(shù)Histopathologic technology生命科學(xué)研究中心 邢立強2ppt課件組織病理學(xué)制片技術(shù)Histopathologic tech目的和要求Aims and Requirements了解生物組織的特點及取材的注意事項；熟悉切片的原理、一般要求及注意事項；掌握石蠟切片制作技

2、術(shù)；3ppt課件目的和要求Aims and Requirements了解生病理學(xué)常用的觀察手段The common survey means in pathology1、大體標(biāo)本觀察：主要用肉眼、量尺及各種衡器等輔助工具，對所檢標(biāo)本的大小、形狀、色澤、重量、表面及切面、病灶特點進(jìn)行觀察及測量。2、組織切片的觀察：取正?；虿∽兘M織進(jìn)行切片、染色(HE染色最常用)在顯微鏡下進(jìn)行觀察。4ppt課件病理學(xué)常用的觀察手段The common survey m病理學(xué)標(biāo)本的種類Types of pathologic samples 1、活體組織檢查(Biopsy)：簡稱活檢，從患者活體局部切取、鉗咬、細(xì)針吸

3、取和摘取等手術(shù)方法獲取病變組織進(jìn)行病理檢查。2、脫落細(xì)胞學(xué)檢查(Exfoliative cytological exam)：對患者痰液、胸腹水、尿液以及陰道刮片、食管拉網(wǎng)、纖維胃/支氣管鏡所取得的材料進(jìn)行涂片，以檢查脫落細(xì)胞，是早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤的好方法。5ppt課件病理學(xué)標(biāo)本的種類Types of pathologic s3、尸體解剖(Autopsy)：通過尸檢可查出病因和病變，及時發(fā)現(xiàn)和確診某些傳染病、新發(fā)現(xiàn)的疾病，積累經(jīng)驗，提高診療水平。4、動物實驗(Animal experiment)：根據(jù)研究需要，在動物身上復(fù)制人類某些疾病的模型、進(jìn)行觀察研究，了解疾病的病因、發(fā)病機(jī)制及藥物療效等。

4、5、組織/細(xì)胞培養(yǎng)(Tissue and Cell culture)：將某種組織或單細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，來研究各種病因作用下組織、細(xì)胞的病理變化及治療效果。6ppt課件3、尸體解剖(Autopsy)：通過尸檢可查出病因和病變，及病理技術(shù)的應(yīng)用Application of pathologic technique幫助臨床查明死因(尸檢);手術(shù)后病變標(biāo)本，明確診斷(臨床活檢);為教學(xué)、科研提供資料;7ppt課件病理技術(shù)的應(yīng)用幫助臨床查明死因(尸檢);7ppt課件取材(Sample collection)固定(Fixation)脫水(Dehydration)透明(Transparentiz

5、ing) 浸蠟(Paraffin soaking)包埋(Embedding)第一節(jié) 組織處理Tissue processing8ppt課件取材(Sample collection)固定(Fixat 1. 人為因素 2. 標(biāo)本大小 3. 取材時間 4. 包埋方向 5. 邊緣標(biāo)記一、取材(Samples collection)9ppt課件 1. 人為因素一、取材(Samples collecti 6. 小標(biāo)本的處理方法 7. 特殊情況取材 8. 取材數(shù)量 9. 清除多余成分 10. 重復(fù)取材 11. 核對取材12. 剩余組織存放 10ppt課件 6. 小標(biāo)本的處理方法 10ppt課件二、固定(Fi

6、xation)固定就是用物理或化學(xué)方法，阻止組織細(xì)胞離體或培養(yǎng)細(xì)胞脫離生存環(huán)境后發(fā)生形態(tài)學(xué)變化。(一)固定的目的1. 迅速阻斷組織細(xì)胞離體后的自溶性變化，防止腐敗，盡量保持組織細(xì)胞生活狀態(tài)下的形態(tài)結(jié)構(gòu)。2. 使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，并保持原有的空間位置。3. 固定劑有硬化作用,增加組織的硬度,便于制片。4. 組織中的各種物質(zhì)經(jīng)固定后產(chǎn)生對染料的親和力，利于染色和觀察。11ppt課件二、固定(Fixation)固定就是用物理或化學(xué)方法，阻止組（二）常用的固定方法1. 浸泡固定法 2. 灌注固定法 3. 細(xì)胞涂片的固定方法4. 微波固定法5. 蒸氣固定法12ppt課件

7、（二）常用的固定方法1. 浸泡固定法 12ppt課件（三）常用的固定液1. 單純固定液(1) 甲醛(formaldehyde)(2) 酒精(alcohol)(3) 苦味酸(picric acid) (4) 丙酮(acetone)(5) 醋酸(acetic acid) 13ppt課件（三）常用的固定液1. 單純固定液13ppt課件2. 混合固定液(1) Bouin液 ：用于結(jié)締組織及脂肪染色；(2) Zenker液：常用于三色染色； (3) 4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉-氫氧化鈉液； 14ppt課件2. 混合固定液14ppt課件（四）固定后的處理1. 一般固定液(甲醛等)固定組織后，用流水沖洗以清除

8、組 織內(nèi)的固定液終止固定。2. 含有乙醇、乙酸及苦味酸的固定液，組織固定后不需要或不能用水沖洗。3. 含有鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸的固定液，組織固定后應(yīng)充分水洗，一般為1224h。4. 用含汞的固定液固定組織后，要進(jìn)行脫汞處理，可在組織脫水前或切片染色前進(jìn)行，一般多在染色前脫汞。其方法為切片脫蠟入水后，入0.5%碘乙醇510min，水洗后再入3%5%硫代硫酸鈉或95%乙醇12min，再充分水洗，蒸餾水洗后進(jìn)行染色。15ppt課件（四）固定后的處理15ppt課件（五）固定時的注意事項1. 標(biāo)本 應(yīng)新鮮并及時取材，快速放入固定液中。特殊標(biāo)本應(yīng)單獨固定和存放。2. 固定液的用量 一般固定液用量為組織塊體

9、積的1020倍，貴重的固定液不少于35倍。避免組織緊貼容器底部，影響固定效果。對于特殊染色的組織(如神經(jīng)染色及酶組織化學(xué)染色等)固定時應(yīng)考慮組織塊的大小、固定液種類、固定時間和溫度等。酶組織化學(xué)染色組織的固定應(yīng)置于冰箱4固定。16ppt課件（五）固定時的注意事項16ppt課件3. 防止組織變形 柔軟或較薄的組織先平鋪在吸水紙上，再投入固定劑中；含氣或脂肪多的組織易浮于液面，可在組織表面覆蓋棉花以達(dá)到充分固定。4. 固定液的穿透性 一般固定液在24h內(nèi)不能穿透厚度大于23mm的實體組織或5mm的多孔疏松組織，故取材組織塊的厚度原則上不應(yīng)超過34mm。5. 固定時間 固定的時間與固定液的種類、組織

10、類型、塊大小、溫度等有關(guān)。一般1.5cm1.5cm0.2 0.3cm大小的組織塊, 固定時間為1224h。6. 固定溫度 大多數(shù)可在室溫(25)固定，在低溫(如4)固定時，固定時間要相應(yīng)延長。17ppt課件3. 防止組織變形 柔軟或較薄的組織先平鋪在吸水紙上，再三、脫水(Dehydration)組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分，水與石蠟不能混溶。因此在浸蠟和包埋前，必須進(jìn)行脫水。 常見的脫水劑有乙醇、正丁醇、丙酮等。為防止水份丟失過快，造成組織變形，一般采用梯度脫水法。也就是使脫水劑的濃度逐漸升高，脫水過程盡量緩和，減少組織變形。 18ppt課件三、脫水(Dehydration)18ppt課件四、

11、透明(Transparentizing)常用的透明劑有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、環(huán)己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。目前也有用環(huán)己酮作為透明劑，環(huán)己酮為無色無毒液體，可與苯、二甲苯和酒精等相混合，也可溶解石蠟。而且脫水時組織不收縮變硬，用于快速石蠟切片效果較好。 19ppt課件四、透明(Transparentizing)常用的透明劑有二五、浸蠟(Paraffin wax soaking)用熔化的切片石蠟逐漸替換組織中二甲苯的過程。20ppt課件五、浸蠟(Paraffin wax soaking)用熔化的21ppt課件21ppt課件22ppt課件22ppt課件六、組織的包埋和包埋方法(E

12、mbedding)（一）常規(guī)石蠟包埋 （二）脫落細(xì)胞標(biāo)本的包埋 （三）微小標(biāo)本的包埋 23ppt課件六、組織的包埋和包埋方法23ppt課件24ppt課件24ppt課件25ppt課件25ppt課件26ppt課件26ppt課件27ppt課件27ppt課件第二節(jié) 組織切片法(Tissue sectioning)組織切片法包括石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、樹脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。常用的切片工具包括組織切片機(jī)、切片刀和自動磨刀機(jī)等。 28ppt課件第二節(jié) 組織切片法(Tissue sectioning)一、組織切片機(jī)和切片刀1. 石蠟切片機(jī) 2. 火棉膠切片機(jī) 3. 恒冷箱切片機(jī)

13、4. 震動切片機(jī) 石蠟切片機(jī)震動切片機(jī)恒冷箱切片機(jī)29ppt課件一、組織切片機(jī)和切片刀石蠟切片機(jī)震動切片機(jī)恒冷箱切片機(jī)29p切片刀切片刀是切片機(jī)的重要部件，常見的有兩種： 一種為可重復(fù)使用的鋼刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、2024cm等，根據(jù)切片刀的形態(tài)，有平凹型、深平凹型、平楔型、雙凹型。 另一種為一次性鋼刀片，是一種薄型切片刀片，用于普通石蠟切片。使用時固定在特制的刀架上。30ppt課件切片刀30ppt課件各種切片刀的剖面圖a平凹形 b深平凹形 c平楔形 d雙凹形31ppt課件各種切片刀的剖面圖a平凹形 b深平凹形 c平石蠟切片機(jī)用一次性鋼刀片32ppt課件石蠟切片機(jī)用一次

14、性鋼刀片32ppt課件二、組織切片(Tissue sectioning)石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用、最普遍的一種方法。 33ppt課件二、組織切片(Tissue sectioning)石蠟切片仍(一)切片前的準(zhǔn)備1. 備齊常用器具, 如玻片、毛筆和鉛筆或刻字筆。2. 檢查切片機(jī)的工作狀態(tài), 將固件都擰緊，檢查切片刀是否鋒利, 切片刀質(zhì)量是保證切片的關(guān)鍵。如果使用一次性刀片, 應(yīng)根據(jù)切片情況及時調(diào)整刀刃位置。34ppt課件(一)切片前的準(zhǔn)備34ppt課件3. 清潔玻片的方法（1）新載玻片的處理： 先用清潔液浸泡1224h, 流水充分沖洗后, 用蒸餾水洗35遍, 95%酒精浸泡2h,

15、 用綢布擦干或用烘箱烤干備用。清潔液是用重鉻酸鉀和濃硫酸按比例配成的洗液。常用的有以下幾種配方：重鉻酸鉀(g):濃硫酸(ml):蒸餾水(ml)=1:1:10;重鉻酸鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:3:25;重鉻酸鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:5:15。 35ppt課件3. 清潔玻片的方法35ppt課件（2）蓋玻片的處理：蓋玻片可按以上方法處理，但因蓋玻片很薄，以上處理程序應(yīng)縮短。清潔液浸泡2h，流水沖洗。也可用以下方法清洗:蓋玻片立排于臥式染缸(排2行，中間隔以載玻片)。松緊度以玻片可輕松轉(zhuǎn)動為好，以下步驟應(yīng)保持液體進(jìn)入每個玻片間隙，玻片之間不能有氣泡。用1%鹽酸酒精浸泡2h，然后流水沖洗干凈，再用蒸餾水沖

16、洗數(shù)次。入95%酒精浸泡23h，無水酒精浸泡20min，倒掉酒精放60烘箱烤干備用。 36ppt課件（2）蓋玻片的處理：蓋玻片可按以上方法處理，但因蓋玻片很薄，（二）切片制作過程1. 蠟塊在冰箱中預(yù)冷，然后固定在切片機(jī)上。將切片刀裝在刀架上。調(diào)整蠟塊與刀的位置，使蠟塊切面與刀刃接近。2.切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，使用時左手執(zhí)毛筆，右手旋轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪。先修出標(biāo)本，直到組織全部暴露于切面為止，標(biāo)本過小時修塊應(yīng)多加注意，大標(biāo)本要切全。切出蠟帶后，用毛筆輕輕挑起一端，用鑷子夾起另一端，正面向上放入展片水槽中(水溫一般低于蠟熔點1012)，待切片展平后，即可進(jìn)行撈片。37ppt課件（二）切片制作過程37ppt課

17、件3. 切片時刀是由下向上運動，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬脆難切的部分放在上端(如皮膚組織的表皮部分，胃腸等組織的漿膜面等)。4. 撈片時注意組織片的擺放位置，盡量整齊美觀。要留出貼標(biāo)簽的空間，5. 撈片時注意在切片和玻片之間不要留有氣泡。撈好的切片應(yīng)在60左右烤箱內(nèi)烤至少30min。以防染色時脫片。38ppt課件3. 切片時刀是由下向上運動，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)39ppt課件39ppt課件40ppt課件40ppt課件41ppt課件41ppt課件（三）石蠟切片制作時的注意事項(Attentions)1. 組織的取材和固定 ；2. 組織脫水、透明和浸蠟 ；3.

18、切片組織塊固定不牢時； 4. 切片刀和切片機(jī) ；5. 特殊要求切片的制作 。42ppt課件（三）石蠟切片制作時的注意事項42ppt課件第三節(jié) 冰凍切片法(Frozen sectioning)冰凍切片可用于新鮮組織、甲醛固定的組織和低溫冰箱冷藏的組織塊等。已固定的組織塊經(jīng)流水沖洗后再進(jìn)行切片。43ppt課件第三節(jié) 冰凍切片法(Frozen sectioning)冰一、冰凍切片法（一）恒冷箱切片機(jī)提前開機(jī)預(yù)冷，一般工作溫度設(shè)定在-22左右。待刀臺、樣品臺和箱內(nèi)達(dá)到設(shè)置溫度后即可切片。順序如下：將組織用OCT粘在樣品托后放置在速凍臺上；組織凍結(jié)后，將樣品托固定到樣品臺上；調(diào)整組織切面與刀刃位置，初步

19、修出組織切面后，放下防卷板，關(guān)閉觀察窗，開始切片。切出的切片粘貼到載玻片上，直接凍存或吹干固定。（二）半導(dǎo)體制冷切片機(jī) 44ppt課件一、冰凍切片法44ppt課件二、冰凍組織的取材及保存方法（一）取材負(fù)責(zé)診斷的醫(yī)師應(yīng)親自檢查大體標(biāo)本，做多切面詳細(xì)檢查，必要時可在解剖鏡下觀察。選取最具代表性的組織制片，必要時應(yīng)多點取材。如切面有特殊要求，應(yīng)向技術(shù)人員說明。取材和切片的剩余組織須進(jìn)一步做石蠟切片進(jìn)行對照，有利于病理醫(yī)師對照閱片，不斷提高觀察冰凍切片的水平。45ppt課件二、冰凍組織的取材及保存方法（一）取材45ppt課件（二）保存方法組織速凍的方法很多，常用方法為液氮和干冰丙酮法。1. 液氮法：將

20、組織塊平放于瓶蓋或標(biāo)本盒等適當(dāng)容器內(nèi)，緩慢放入盛有液氮的容器內(nèi)。當(dāng)組織塊凍結(jié)后，取出用鋁箔包好，做好標(biāo)記后入液氮罐或-70低溫冰箱保存?？杀４鏀?shù)月至數(shù)年。如短期內(nèi)使用，可保存于-30冰箱。46ppt課件（二）保存方法46ppt課件2. 干冰-丙酮法：將組織塊放入盛有OCT包埋劑的標(biāo)本盒內(nèi)，使組織塊完全浸沒。將丙酮倒入盛有10g干冰的保溫杯調(diào)成糊狀。將裝有組織塊的標(biāo)本盒放入保溫杯，待包埋劑成白色凍塊時，取出如上法保存。此法組織速凍快，組織結(jié)構(gòu)保存好。47ppt課件2. 干冰-丙酮法：將組織塊放入盛有OCT包埋劑的標(biāo)本盒內(nèi)，3. 異戊烷-液氮法：此法的優(yōu)點可防止冰晶破壞組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對含水較

21、多的組織適宜用此法進(jìn)行速凍。先用甲基纖維素包埋組織塊。將盛有異戊烷的小燒杯放入裝有液氮的大保溫杯或冰壺內(nèi)，攪拌異戊烷待杯底出現(xiàn)一層白色糊狀物時，放入包埋好的組織塊，數(shù)秒鐘即可取出，按上述方法保存。48ppt課件3. 異戊烷-液氮法：此法的優(yōu)點可防止冰晶破壞組織細(xì)胞的形態(tài)（三）注意事項1. 液氮速凍時，標(biāo)本盒不能直接浸入液氮，以免組織膨脹破碎。2. 速凍的包埋劑應(yīng)適量。3. 新鮮組織不能放入-10冰箱內(nèi)緩慢冷卻，否則組織內(nèi)水分可逐漸析出形成冰晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞。4. 冷凍后的組織塊應(yīng)密封保存，防止失水。5. 在組織塊復(fù)溫時，應(yīng)在37加溫速融，自然復(fù)溫將造成組織結(jié)構(gòu)破壞。49ppt課件（三）注意

22、事項49ppt課件第四節(jié) 脫落細(xì)胞制片技術(shù)Preparation of Exfoliative cytologic samples脫落細(xì)胞標(biāo)本包括：胸水、腹水、尿液、腦脊液穿刺液和一些涂片、刷片及印片的細(xì)胞，在臨床上具有非常重要的診斷價值。50ppt課件第四節(jié) 脫落細(xì)胞制片技術(shù)Preparation of E一、細(xì)胞標(biāo)本的取材細(xì)胞標(biāo)本取材和制片方法一般有印片法、穿刺法、沉淀法和活細(xì)胞標(biāo)本的制備等。(一)印片法常用于活檢和手術(shù)標(biāo)本，新鮮標(biāo)本沿病灶中心剖開，將載片輕壓于切面上，吹干后立即浸入固定液內(nèi)5l0min，取出自然干燥，低溫儲存。優(yōu)點是操作簡單，細(xì)胞抗原保存好。51ppt課件一、細(xì)胞標(biāo)本的取

23、材51ppt課件(二)穿刺液沉淀法常用于淋巴結(jié)、軟組織、肝、腎和肺等，穿剌液少，可直接涂片，細(xì)胞盡量涂均勻。穿刺液多，細(xì)胞豐富，可置離心管內(nèi)，以500rpm低速離心5l0min，棄上清，將沉淀制成細(xì)胞懸液(2105細(xì)胞/ml)。52ppt課件(二)穿刺液沉淀法52ppt課件涂片鏡檢, 以細(xì)胞較密不重疊為好。干燥后固定。胸水、腹水、尿液和腦脊液等如細(xì)胞較少時，也可用此方法制片。此法細(xì)胞保存好，操作簡單。注意涂片時，盡量涂均勻。(三)單核細(xì)胞分離法主要用于外周血和胸腹水中淋巴細(xì)胞的分離。如為血性胸腹水，經(jīng)上述方法分離淋巴細(xì)胞然后在37培養(yǎng)30min，離心沉淀取上清，制成濃度為2106細(xì)胞/ml的細(xì)

24、胞懸液，吸50l涂片，略干后固定l0min。53ppt課件涂片鏡檢, 以細(xì)胞較密不重疊為好。干燥后固定。胸水、腹水、尿54ppt課件54ppt課件55ppt課件55ppt課件宮頸脫落細(xì)胞涂片見分化不良細(xì)胞體積大、核深染；正常上皮細(xì)胞核小、胞漿豐富。56ppt課件宮頸脫落細(xì)胞涂片56ppt課件二、血涂片的制作血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，制備厚薄適宜、分布均勻、染色良好的血涂片是血液學(xué)檢查的基本技術(shù)之一。(一)操作步驟1. 消毒：先按摩取血部位，使血流通暢；再用酒精消毒采血針和取血部位(如指尖)。2. 取血：待酒精干后，刺破皮膚，使血自然流出，勿擠。取干凈載片，

25、讓血滴在離載片一端中45mm處，注意手指持握載片的邊緣，勿觸及其表面。不能使載片接觸取血部位的皮膚。57ppt課件二、血涂片的制作57ppt課件3. 推片：取一張邊緣光滑的載片。將其一端置于血滴前方，向后移動到接觸血滴，使血液均勻分散在推片與載片的接觸處。然后使推片與載片呈3040角，向另一端平穩(wěn)地推出。涂片推好后，通過搖擺使之快速干燥。4. 染色：用特種玻璃鉛筆在血膜兩側(cè)畫兩條線，防止染液外溢。再將瑞氏染液(伊紅-亞甲基藍(lán))滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染半分鐘。加等量蒸餾水(或緩沖液)與染液混合再染5分鐘。最后用蒸餾水把染液沖掉，用吸水紙吸干，自然干燥后，即可觀察。58ppt課件3. 推片：取一張邊緣光滑的載片。將其一端置于血滴前方，向后（二）注意事項活細(xì)胞標(biāo)本制備中玻片的清洗：新玻片常