(整理)黃曲霉素測(cè)定方法

1、黃曲霉毒素測(cè)定法簡(jiǎn)述黃曲霉毒素可以有曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和偽溜曲霉4種真菌產(chǎn) 生，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類素的二呋喃香豆素的衍生化合物，中藥在貯藏、制備、運(yùn) 輸過程中如保存不當(dāng)有受潮霉變而污染黃曲霉毒素的可能。黃曲霉毒素是目前世 界上已知的毒性最強(qiáng)的化合物之一，其致癌性肯定。對(duì)中藥中黃曲霉毒素殘留量 進(jìn)行嚴(yán)格控制對(duì)保證藥用安全具有重要意義。本法的基本原理為樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取、免疫親和柱凈化后，利用高效液相 色譜分離，柱后碘衍生-熒光檢測(cè)器檢測(cè)進(jìn)行分析測(cè)定。儀器與用具高速勻漿機(jī)、振蕩器2.2高效液相色譜單元,配熒光檢測(cè)其（具360nm激發(fā)波長和大于420nm發(fā)射波長）柱后衍生系統(tǒng)離心機(jī)超純水

2、處理系統(tǒng)黃曲霉總量（ B 、B 、G 、G ）免疫親和柱1212固相萃取裝置離心管,具塞錐形瓶,刻度濃縮瓶,移液管,容量瓶等。試藥與試液甲醇、乙腈均為色譜純。水位高純水。黃曲霉毒素混合對(duì)照品。0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100m l使溶解，用水稀釋至1000ml即 得。4. 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙 腈-水（40:18:42）為流動(dòng)相，流速每分鐘0.8m；采用柱后衍生法檢測(cè)，（1）碘 衍生法：衍生溶液為0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100 ml使溶解，用水稀 釋至1000m l制成），衍生化泵流速每分鐘0.3ml，衍生化溫度

3、70C ；以熒光檢測(cè) 器檢測(cè)，激發(fā)波長九ex =360nm，發(fā)射波長九em =450nm。進(jìn)樣量：2050“l(fā) （視 靈敏度進(jìn)行調(diào)整）。按上述條件操作，理論板數(shù)以B計(jì)應(yīng)不低于5000，兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大1于1.5。5.操作方法5.1混合對(duì)照品溶液的制備 精密量取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)示濃度分別為 1. Opg/ml、0.3yg/ml、1.0yg/ml、0.3yg/ml、）0.5ml， 置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1ml，置25ml 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得。5.2供試品溶液的制備取供試品粉末約15g（過二號(hào)

4、篩），精密稱定，加入氯化 鈉3g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速攪拌2分鐘（攪拌速度 大于11, 000轉(zhuǎn)/分），離心5分鐘（離心速度2500轉(zhuǎn)/分），精密量取上清液15ml， 置50m l量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 pm）濾過，量取續(xù) 濾液20.0ml，通過免疫親合柱，流速每分鐘3 ml，用水20m l分兩次洗脫，洗脫液 棄去，使空氣進(jìn)入柱子,將水?dāng)D出柱子，再用1.5ml甲醇分次洗脫，收集洗脫液，置 2ml量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。5.3測(cè)定法分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液5pl、10pl、15pl、20pl、25pl，注 入液相色譜

5、儀，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。另精密吸取上述供試品溶液2025pl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，從標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B、B、G、G的量，計(jì)算，即得。12126 注意事項(xiàng)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施，并不得污染環(huán)境。殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)置于專用貯存容器（裝有 10%次氯酸鈉溶液）內(nèi)，浸泡 24 小時(shí)以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。實(shí) 驗(yàn)廢液也需加入次氯酸鈉進(jìn)行處理。紫外線對(duì)低濃度黃曲霉素有一定的破壞性，所以混合黃曲霉毒素對(duì)照品儲(chǔ) 備液應(yīng)配制在棕色容量瓶中，并避光保存?；旌宵S曲霉毒素對(duì)照品溶液則需臨用 新配嗎，并注

6、意避光。6.4當(dāng)供試品試液進(jìn)樣量超過20“l(fā)時(shí)，為保證獲得良好的額色譜峰形，供試液 制備中最后可用水稀釋至刻度。6.5隨行回收綠：加標(biāo)濃度Vl.Op g/Kg,回收率應(yīng)在50%120%；加標(biāo)濃度110 卩g/Kg，回收率應(yīng)在70%110%。6.6方法檢出限以黃曲霉毒素b1計(jì)應(yīng)不得高于0.5g/Kg。7 附注：光化學(xué)衍生法 除上述中國藥典2010版已收載的柱后碘衍生-熒光檢測(cè)測(cè)定方法外，柱后 光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)測(cè)定方法在儀器性能和測(cè)定的穩(wěn)定性方面也有明顯的優(yōu) 勢(shì)。儀器與用具光化學(xué)衍生器色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫： 40C；以甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相，按下表進(jìn)行梯度洗脫，流速l.lml/min；采用柱 后光化學(xué)衍生：光化學(xué)衍生器（254nm）；以熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長Lex =360nm，發(fā)射波長Lem =4