胞核胞漿胞膜制備試劑盒

1、 技術(shù)咨詢電話：400-607-9999注意：本制品僅供研究使用，請(qǐng)勿用于臨床治療等其他用途胞核胞漿胞膜制制備試劑盒 Nucl-Cyyto-Meem Preeparattion KKit貨號(hào)：P0600004描述：從哺乳動(dòng)動(dòng)物新鮮或凍凍存的組織塊塊、貼壁或懸懸浮培養(yǎng)細(xì)胞胞中，制備細(xì)細(xì)胞核、細(xì)胞胞膜與胞內(nèi)質(zhì)質(zhì)膜、細(xì)胞漿漿等三種主要要亞細(xì)胞組分分。獨(dú)特的試試劑成分與優(yōu)優(yōu)化的制備方方案相結(jié)合，使使胞核-胞膜-胞漿制備過(guò)過(guò)程簡(jiǎn)單易行行，無(wú)需特殊殊設(shè)備和超速速離心，制備備過(guò)程可在11小時(shí)內(nèi)完成成。制備的細(xì)細(xì)胞核、細(xì)胞胞漿組分純度度甚高，而且且較少交叉污污染。單一的的細(xì)胞膜的純純化是一個(gè)特特殊問(wèn)題，本本試

2、劑盒制備備的胞膜是細(xì)細(xì)胞膜和細(xì)胞胞器如線粒體體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高高爾基體及其其質(zhì)膜的混合合物。制備的的細(xì)胞核是完完整的未裂解解的細(xì)胞核，但但胞漿組分為為可溶性胞漿漿蛋白。制備備的亞細(xì)胞組組分的純度可可勝任后續(xù)免免疫共沉淀、SDS、2-D gel電泳、Western Blotting、酶活性測(cè)定、受體分析等。組成：(50 extraactionns, 8 x 1066 cellls perr extrractioon)CER, Cyytosoll Extrractioon Reaagent，25ml; MER, Meembranne Exttractiion Reeagentt，2.5 mllNER,

3、 Nucleear Exxtracttion RReagennt，50 ml;Suspenssion BBufferr，10 ml 儲(chǔ)存：4 CC避光保存1年。收集細(xì)胞：準(zhǔn)確確計(jì)數(shù)，每一一制備使用等等量的細(xì)胞數(shù)數(shù)，將明顯改改善后續(xù)檢測(cè)測(cè)結(jié)果的一致致性。每一制制備約需要88 x 1006 1 x 1077個(gè)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞：PBBS沖洗細(xì)胞胞皿，胰蛋白白酶消化細(xì)胞胞。800 x g 離離心5-100 min。棄棄上清，用PPBS重懸洗洗滌細(xì)胞并再再次離心收集集細(xì)胞。注意意：為避免胰胰蛋白酶在后后續(xù)制備過(guò)程程中降解蛋白白質(zhì)，可用無(wú)無(wú)酶細(xì)胞消化化液(Non-eenzymee Celll Disaass

4、ociiation Soluttion)使貼壁培養(yǎng)養(yǎng)的細(xì)胞與瓶瓶皿分離。懸浮細(xì)胞：8000 x gg 離心5-100 min。棄棄上清。用PPBS重懸洗洗滌細(xì)胞并再再次離心收集集細(xì)胞。估計(jì)細(xì)胞沉淀壓壓積PCV (packked ceell voolume)：通常1 x 106 個(gè)細(xì)胞離心心后的PCVV約為10-20 l，1 x 1107 個(gè)細(xì)胞的PCCV約為100 l。注意PCVV大小與細(xì)胞胞數(shù)量有關(guān)，也也與細(xì)胞類型型、大小、離離心速度有關(guān)關(guān)。制備步驟 制備全程在4 C或冰水水浴中進(jìn)行。1.1 細(xì)胞勻勻漿裂解每1 x 1007個(gè)細(xì)胞或100 l PCV的細(xì)胞胞沉淀加入5500 l CER試劑劑

5、，震蕩重懸懸。冰浴2 min。將將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷冷的玻璃勻漿漿器內(nèi)。冰上上上下手動(dòng)勻勻漿20-330次。注意：破破碎細(xì)胞是關(guān)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。用用1-3 mml小容積玻玻璃勻漿器，須須選用間隙嚴(yán)嚴(yán)密的研杵，其其特征是將研研杵插入勻漿漿器套管后，可可提起研杵而而套管不會(huì)脫脫落。有效研研磨是上下推推拉研磨而不不是旋轉(zhuǎn)。破破碎效果與細(xì)細(xì)胞類型有關(guān)關(guān)?？稍谙嗖畈铒@微鏡下檢檢查，未裂解解細(xì)胞應(yīng)少于于5%。1.2 組織塊塊勻漿裂解取250 mgg哺乳動(dòng)物新新鮮或-800 C凍存存的組織塊，勿勿剪碎為更小小的塊。放入入冰預(yù)冷的玻玻璃勻漿器內(nèi)內(nèi)。加入500 l CER試劑劑。用研杵旋旋轉(zhuǎn)將組織塊塊搗碎，上下下

6、手動(dòng)預(yù)勻漿漿20次。冰浴浴10 miin。然后上上下手動(dòng)預(yù)勻勻漿7次。注意：與培養(yǎng)細(xì)細(xì)胞特別是貼貼壁細(xì)胞相比比，組織塊中中的細(xì)胞在勻勻漿時(shí)較易破破碎，因而并并非必須選用用間隙嚴(yán)密的的研杵。如果果研杵與套管管過(guò)于嚴(yán)密，組組織勻漿困難難，可選用研研杵與套管稍稍松的勻漿器器。破碎效果果與組織細(xì)胞胞類型有關(guān)。可可在相差顯微微鏡下檢查，未未裂解細(xì)胞應(yīng)應(yīng)少于5%。2. 取出5500 l裂解混合物物，轉(zhuǎn)移到11.5 mll離心管。800 g，4 C離心心5 minn。粗細(xì)胞核核沉淀在管底底，上清為胞胞膜-胞漿混合物物。按照以下下步驟首先制制備膜與胞漿漿，然后制備備細(xì)胞核，或或用兩臺(tái)離心心機(jī)同時(shí)制備備。3.

7、膜與胞漿漿制備：3.1. 將步步驟2 獲得的上上清液轉(zhuǎn)移到到新管，估計(jì)計(jì)上清液體積積；3.2. 立即即加入1/110積量的MERR與上清液混混合。冰浴55分鐘；3.3. 最大大轉(zhuǎn)速14,000 rrpm 4 C離心30分鐘；3.4. 取出出上清液轉(zhuǎn)移移到新管，此此為胞漿組分分；3.5. 沉淀淀為胞膜組分分，含細(xì)胞膜膜和細(xì)胞內(nèi)質(zhì)質(zhì)膜的混合物物。再次瞬時(shí)時(shí)離心除盡液液體，用1000 l或適宜體積的的Suspeensionn Bufffer或自備備溶液重懸胞胞膜。4. 細(xì)胞核制制備：4.1. 加入入500 l NERR，振蕩重懸懸步驟2 獲得的粗粗核。必要時(shí)時(shí)按步驟1.1勻漿胞核核；4.2. 400

8、00 g，4 C離心心5 minn。棄上清；4.3. 再次次加入5000 l NERR洗滌胞核沉淀淀，并重復(fù)步步驟4.2，離心心后的上清應(yīng)應(yīng)清亮；4.4. 棄上上清除盡液體體。用1000 l或適宜體積Suuspenssion BBufferr或自備溶液液重懸細(xì)胞核核。說(shuō)明制備的胞漿組分分或重懸于SSuspennsion Buffee的胞膜胞核核組分可進(jìn)行行Bradfford法、Lowrry法、BCA法蛋白白定量、酶活活性測(cè)定、受受體分析。但但進(jìn)行免疫共共沉淀、SDDS-PAGGE、2-D ggel電泳、Wesstern Blot之之前，需要11:1加入自自備的2x 樣品緩沖液液(含適宜濃度度的去垢劑如如NP-400、Tritoon X-1100、SDS)。用用戶可不用KKit中的Susppensioon Bufffer，而而直接用自行行配制的樣品品緩沖液重懸懸胞核或胞漿漿沉淀，但這這是要考慮自自配緩沖液中中是否有影響響蛋白定量的的因素。用SDS-PAAGE Looadingg 緩沖液裂裂解細(xì)胞核后后，DNA釋放會(huì)會(huì)使核裂解物物十分粘稠，可可95 CC加熱5 miin，高速振振蕩打斷DNNA，重復(fù)加加熱2-3次。如果為凝膠阻滯滯實(shí)驗(yàn)(EMMSA)目的的提取核蛋白白，建議用#P12000: 核-胞漿蛋白制制備試劑盒