基因工程原理和技術(shù)

1、關(guān)于基因工程的原理和技術(shù)第1頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四一、基因工程的操作步驟： 目的基因的獲?。?形成重組DNA分子； 重組DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞； 篩選含有目的基因的受體細(xì)胞； 目的基因表達(dá)。第2頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四1.第一步：目的基因的獲取（1）方法： 從基因文庫(kù)中獲取目的基因 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增目的基因（目的基因的序列已知） 化學(xué)方法合成目的基因（目的基因的序列已知）第3頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四 從基因文庫(kù)中獲取目的基因用限制酶切成許多片斷 將含有某種生物不同基因的許多DNA

2、片斷，導(dǎo)入受體菌的群體儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。第4頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基因。第5頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR技術(shù)）變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA復(fù)性（退火）：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：以目的基因?yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的新DNA鏈第6頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四雙鏈DNA1.變性升溫至95單鏈DNA2.復(fù)性降溫至

3、60引物與母鏈結(jié)合3.延伸升溫至72DNA聚合酶解旋PCR技術(shù)與原理Taq DNA聚合酶有耐高溫的特點(diǎn)第7頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四思考：PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，需要什么前提和條件？過(guò)程如何？原理是什么？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))擴(kuò)增原理：目的：前提：條件：DNA復(fù)制獲得大量的目的基因有一段已知目的基因（兩端）的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物。模板DNA（目的基因）耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)四種脫氧核苷酸兩種DNA引物第8頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四人工合成基因的方法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA化學(xué)方法合

4、成目的基因第9頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)化學(xué)方法合成目的基因通過(guò)化學(xué)合成的目的基因是否含有粘性末端？第10頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四大片段DNA打成許多小片段小片段DNA目的基因載入運(yùn)載體細(xì)菌重組DNA分子重組DNA分子例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲(chóng)蛋白的基因如果運(yùn)氣不好，在打成小片段時(shí)，有可能把抗蟲(chóng)基因打斷基因組文庫(kù)第11頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四

5、如何從基因文庫(kù)中獲取目的基因?大片段DNA打成許多小片段小片段DNA目的基因載入運(yùn)載體細(xì)菌重組DNA分子重組DNA分子基因組文庫(kù)對(duì)基因組文庫(kù)的所有細(xì)菌進(jìn)行逐一篩查找出有抗蟲(chóng)蛋白的菌落該菌落所攜帶的基因片段就含有目的基因例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲(chóng)蛋白的基因容易嗎？第12頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四 2、形成重組DNA分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體)基因表達(dá)載體的組成啟動(dòng)子目的基因終止子復(fù)制起點(diǎn)標(biāo)記基因通常用同一種限制酶切割目的基因和載體(質(zhì)粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA連接酶將二者連接,形成重組DNA分子（基因表達(dá)載體）。第13頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日

6、，8點(diǎn)14分，星期四3、將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化常用的受體細(xì)胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。第14頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四1.將重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法2.將重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)（最多、最有效）3.將重組DNA導(dǎo)入微生物細(xì)胞Ca2+處理，以增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。第15頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四（1）將重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法第16頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四（2）

7、將重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植第17頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四重組質(zhì)粒大腸桿菌的擬核目的基因氨芐青霉素抗性基因（標(biāo)記基因）將細(xì)菌用CaCl2處理，使細(xì)胞處于感受態(tài)，可促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA分子（3）如果是導(dǎo)入微生物（如細(xì)菌）第18頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四 感受態(tài)：細(xì)胞處于容易吸收外源性DNA的狀態(tài)。 處于感受態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞.CaCl20重組載體感受態(tài)細(xì)胞42第19頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四抗氨芐青霉素基因點(diǎn)為目的基因與質(zhì)粒A的結(jié)合點(diǎn)四環(huán)素抗性基因目

8、前把重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，效率還不高，導(dǎo)入完成后得到的細(xì)菌，實(shí)際上有的根本沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒，有的導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒A，只有少數(shù)導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒。第20頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四 4.篩選含有目的基因的受體細(xì)胞目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記： 如以質(zhì)粒做為載體可進(jìn)行抗性的檢測(cè)原理：質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因方法：利用選擇培養(yǎng)基篩選第21頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四思考：通常為什么要選用含有兩個(gè)標(biāo)記基因的運(yùn)載體？第22頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四沒(méi)有質(zhì)粒含目的基因的質(zhì)粒正常質(zhì)粒第23頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，

9、5月20日，8點(diǎn)14分，星期四沒(méi)有質(zhì)粒含目的基因的質(zhì)粒正常質(zhì)粒第24頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因（關(guān)鍵）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（表達(dá)）（2）常用的技術(shù)：DNA分子雜交技術(shù)蛋白質(zhì)分子（抗原抗體）間的雜交5. 目的基因的表達(dá)（1）內(nèi)容：第25頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四（2）基因工程的的原理及技術(shù)分子水平：DNA分子雜交技術(shù)核心DNA探針目的基因的脫氧核苷酸（單鏈）序列片段用熒光分子或放射性同位素標(biāo)記看能否形成雜合的雙鏈區(qū)第26頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月

10、20日，8點(diǎn)14分，星期四檢測(cè)鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定等過(guò)程:A.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNAB.用含目的基因的DNA片段( 單鏈)用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針C.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中方法:DNA分子雜交方法:分 子 雜 交方法:抗原抗體雜交過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA.第27頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四目的基因與質(zhì)粒的連接第28頁(yè)，共

11、42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四 基因DNA文庫(kù)的構(gòu)建 將總DNA經(jīng)過(guò)酶解，分離不同長(zhǎng)短的DNA片段。包含的基因片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，感染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因文庫(kù)。第29頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四基因探針： 基因探針就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列。它包括整個(gè)基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA。第30頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四DNA分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿

12、基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 第31頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四基因探針（DNA探針）與目的基因雜交，有無(wú)雜交帶第32頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四傳統(tǒng)的遺傳育種方法有哪些？傳統(tǒng)的遺傳育種方法能否解決不同種生物優(yōu)良性狀的重組問(wèn)題？基因工程技術(shù)如何解決不同種生物優(yōu)良性狀的重組問(wèn)題？基因工程的應(yīng)用第33頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四基因工程的應(yīng)用一、基因工程與作物育種二、基因工程與疾病治療（）基因工程藥物（2）基因診斷（3）基因治療三、 基

13、因工程與環(huán)境保護(hù)第34頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四基因工程的應(yīng)用一、基因工程與作物育種1.抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物2.抗病轉(zhuǎn)基因植物3.其他抗逆轉(zhuǎn)基因植物（如抗鹽、抗旱、抗除草劑植物等）4.利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用：1）高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具優(yōu)良品質(zhì)的品種2）抗逆性品種基因工程在畜牧養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用:第35頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四基因工程與疾病治療 基因工程藥品的生產(chǎn)在傳統(tǒng)的藥品生產(chǎn)中，某些藥品如胰島素、干擾素直接生物體的哪些結(jié)構(gòu)中提??？藥品直接從生物的組織、細(xì)胞或血液中提取。傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的缺點(diǎn)由于受原料來(lái)源的限制，價(jià)格十分昂貴?？?/p>

14、利用什么方法來(lái)解決上述問(wèn)題？ 利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生產(chǎn)出各種高質(zhì)量、低成本的藥品。第36頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四基因工程胰島素胰島素是治療糖尿病的特效藥，長(zhǎng)期以來(lái)只能依靠從豬、牛等動(dòng)物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。胰島素分子結(jié)構(gòu)第37頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四基因工程胰島素將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問(wèn)題，還使其價(jià)格降低了30%-50%!胰島素生產(chǎn)車間第38頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四基因工程干擾素干擾素治療病毒感染簡(jiǎn)直是“萬(wàn)能靈藥”！過(guò)去從人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍貴”程度自不用多說(shuō)。干擾素生產(chǎn)車間干擾素分子結(jié)構(gòu)第39頁(yè)，共42頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)14分，星期四SCID的基因工程治療重癥聯(lián)合