色譜-緒論課件

1、第一章 緒論 第一節(jié) 色譜法發(fā)展簡(jiǎn)史一、色譜法的產(chǎn)生 1906 年，俄國(guó)植物學(xué)家Tsweet （茨維特）在研究植物葉子的組成時(shí)，用碳酸鈣作吸附劑，玻璃柱中，石油醚萃取液倒到管中的碳酸鈣上，萃取液中的色素就吸附在管內(nèi)上部的碳酸鈣里，再用純凈的石油醚洗脫被吸附的色素形成3 種顏色的6 個(gè)色帶。當(dāng)時(shí)茨維特把這種色帶叫做“色譜”，固定相 ，沖洗劑石油醚稱(chēng)為流動(dòng)相。把茨維特開(kāi)創(chuàng)的方法稱(chēng)為液一固色譜法( liquid 一solid chromatography ，LSC ) 不僅用于有色物質(zhì)的分離，而且大量用于無(wú)色物質(zhì)的分離。色譜的“色”字雖已失去原有意義，但色譜名詞仍沿用至今。Tsweet 實(shí)驗(yàn)色譜柱C

2、aCO3植物色素的石油醚浸取液石油醚（固定相）（流動(dòng)相）色譜柱固定相CaCO3顆粒流動(dòng)相石油醚 色帶二、色譜法的發(fā)展1931 年德國(guó)的Kuha 和Lederer 才重復(fù)了茨維特的某些實(shí)驗(yàn)，用氧化鋁和碳酸鈣分離了-、 -和， - 胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60 多種此類(lèi)色素。Martin 和Syng 。在1940 年提出液-液色譜法（liquid 一liquid chromatography , LLC ) ，即固定相是吸附在硅膠上的水，流動(dòng)相是某種有機(jī)溶劑。1941 年，Martin 和Synge 提出用氣體代替液體作流動(dòng)相的可能性，11 年之后，James 和Martin 提出了從理論到

3、實(shí)踐較完整的氣-液色譜方法（ GLC ) ，從而獲得了1952 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在此基礎(chǔ)上，1957 年，開(kāi)創(chuàng)了開(kāi)管柱氣相色譜法，習(xí)慣上稱(chēng)為毛細(xì)管柱氣相色譜法。1956 年，前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)展了描述色譜過(guò)程的速率理論，1965 年，Giddings 總結(jié)和發(fā)展了前人的理論，為色譜的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。 另一方面早在1944 年，Consden 等發(fā)展了紙色譜，1949 年，Macllean 等在氧化鋁中加入淀粉粘合劑制作薄層板，使薄層色譜法（thin layer chromatography , TLC ）得以實(shí)際應(yīng)用，而在1956 年，Stahl 發(fā)明出涂布器之后，才使TLC 得到廣泛應(yīng)

4、用。在20 世紀(jì)60 年代末把高壓泵和化學(xué)鍵合相用于液相色譜，出現(xiàn)了高效液相色譜法（high performance liquld chromatogra - phy , HPLC ）。20 世紀(jì)80 年代初超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography , SFC ) 興起。而在20 世紀(jì)90 年代毛細(xì)管區(qū)帶電泳（ CZE ）得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)集HPLC 和CZE 優(yōu)點(diǎn)的毛細(xì)管電色譜在20 世紀(jì)90 年代后期受到關(guān)注。 在藥物分析中，對(duì)于成分復(fù)雜的藥品（如中藥材、中成藥、復(fù)方制劑等）分析、雜質(zhì)檢查、痕量分析或含量相差懸殊的成分的分析課題，通常情況下都首選

5、色譜法，在各國(guó)藥典中都大量收載色譜法，并呈明顯上升趨勢(shì)，是有力的證明。在美國(guó)藥典中，色譜法在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處于最重要的地位，尤其是HPLC 其應(yīng)用頻率逐版上升，至24 版，HPLC 已成為美國(guó)藥典應(yīng)用頻率最高的一種分析方法。 高效液相色譜近年來(lái)以6 -8 的速度增長(zhǎng)，其中較活躍的領(lǐng)域是離子色譜、疏水作用色譜、手性分離及反相色譜。HPLC 除具有GC 的優(yōu)點(diǎn)外，還具有應(yīng)用面廣，可進(jìn)行制備分離的特點(diǎn)，多維色譜，如LC -LC -MS 等用于藥物、蛋白質(zhì)、多肽結(jié)構(gòu)測(cè)定，并使整個(gè)操作完全自動(dòng)化，這是21 世紀(jì)色譜分析的發(fā)展方向之一。面對(duì)基因工程的挑戰(zhàn)，原預(yù)計(jì)到2005 年，人類(lèi)3 萬(wàn)-3.5 萬(wàn)條基因

6、測(cè)序工作可以做完，現(xiàn)已于2000 年完成，這仍然離不開(kāi)現(xiàn)代色譜技術(shù)的應(yīng)用。從某種程度上說(shuō)沒(méi)有色譜法就沒(méi)有人類(lèi)社會(huì)發(fā)展的今天。二、色譜法的分類(lèi) 色譜法從不同的角度，有不同的分類(lèi)方法，通?？砂捶肿泳奂癄顟B(tài)、操作方法及分離原理等進(jìn)行分類(lèi)。（一）按流動(dòng)相與固定相的狀態(tài)分類(lèi)1 按流動(dòng)相的狀態(tài)分類(lèi)：（GC ）、液相色譜（ LC ）和超臨界流體色譜（SFC ）。2 按固定相的狀態(tài)分類(lèi):固定相可以是固體或液體。（GSC ），（GLC ) ，（ LSC ），（LLC ) 。（二）按操作形式分類(lèi) 按操作形式可分為柱色譜法、平面色譜法及逆流分配等類(lèi)別。柱色譜法（cohimn chromatography ）將固定相

7、裝在色譜柱里，色譜過(guò)程在色譜柱內(nèi)進(jìn)行。按色譜柱粗細(xì)，可分為一般柱色譜法、毛細(xì)管柱色譜法及微填充柱色譜法等類(lèi)別。按固定相填充情況，又可分為填充柱色譜法及開(kāi)口柱色譜法2 類(lèi)。氣相色譜法與高效液相色譜法（HPLC ）及超臨界流體色譜法（SFC ）等屬于柱色譜法范圍。高效液相色譜法與經(jīng)典液相柱色譜法不同，主要在于色譜柱內(nèi)填料的性能不同。前者采用高效固定相，而后者用一般固定相。其次是裝置不同，前者儀器化，后者手工操作。 平面色譜法（planar chromaiography ）系色譜過(guò)程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進(jìn)行的色譜法。又分為紙色譜法（paper chromatography , PC ）、薄層色譜法

8、（thin layer chromatography , TLC ）及薄膜色譜法（thin film chromatography , TFC ）等。用濾紙作固定液載體的色譜法稱(chēng)為紙色譜法。將固定相鋪在玻璃板或鋁箔板上，構(gòu)成一定厚度的薄層板，用這種薄層板進(jìn)行分離分析的方法稱(chēng)為薄層色譜法。薄膜色譜法與薄層色譜法類(lèi)似，主要區(qū)別是它的固定相是用高分子材料制成的薄膜。分配色譜法：固定相為液態(tài)，利用樣品組分在固定相與流動(dòng)相中的溶解度不同，引起分配系數(shù)的差別而分離。LLC 與GLC 都屬于分配色譜法范圍。流動(dòng)相的極性大于固定相的極性的液相色譜法，稱(chēng)為反相（reversed phase ,RP ）色譜法；反

9、之，稱(chēng)為正相（normal phase , NP ）色譜法。體積排阻色譜法（size exclusion chromatosraphy , SEC ）也稱(chēng)為凝膠色譜法，是以一定尺寸的多孔固體為固定相，以液體為流動(dòng)相，按分子尺寸大小進(jìn)行分離的方法。多用于高聚物分子質(zhì)量分布和含量的測(cè)定。離子交換色譜法（ion exchange chromatography , IEC ）用離子交換樹(shù)脂為固定相的色譜法稱(chēng)為離子交換色譜法。這種方法是靠樣品離子與固定相的可交換基團(tuán)交換能力（交換系數(shù)）的差別而分離。親和色譜法（affinity chromatography , Ac ）將具有生物活性（如酶、輔酶、抗體等

10、）的配位基鍵合到非溶性載體或基質(zhì)表面上形成固定相。利用蛋白質(zhì)或生物大分子與親和色譜固定相表面上配位基的親和力進(jìn)行分離的色譜法，稱(chēng)為親和色譜法。這種方法專(zhuān)用于分離與純化蛋白質(zhì)等生化樣品。毛細(xì)管電色譜法（ CEC ）其分離機(jī)制是靠色譜與電場(chǎng)2 種作用力，依據(jù)樣品組分的分配系數(shù)及電泳速度差別而分離。該法可分為填充毛細(xì)管電色譜法及開(kāi)管毛細(xì)管電色譜法兩大類(lèi)。前者是將細(xì)粒徑固定相填充在毛細(xì)管柱中，后者是把固定相的官能團(tuán)鍵合在毛細(xì)管內(nèi)壁表面上而形成的色譜柱。毛細(xì)管電色譜法是最新的色譜法，它快速、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用廣，是最有前途的分析方法。毛細(xì)管電泳法（CE ）樣品在毛細(xì)管的液體介質(zhì)中，在電場(chǎng)力作用下的分離分析方法稱(chēng)

11、為毛細(xì)管電泳法。它已成為生命科學(xué)的最重要的研究手段之一。 第三節(jié) 色譜法與其他方法的比較一、色譜法的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)（一）色譜法的特點(diǎn)色譜法是以其高超的分離能力為特點(diǎn)，它的分離效能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他分離技術(shù)如蒸餾、萃取、離心等方法。（二）色譜法的優(yōu)點(diǎn)1 分離效能高。2 應(yīng)用范圍廣。3 分析速度快，一般在幾分鐘到幾十分鐘就可完成一次復(fù)雜樣品的分離和分析。4 樣品用量少。5 靈敏度高如氣相色譜可以分析幾納克的樣品。6 分離和測(cè)定一次完成可以和多種波譜分析儀器聯(lián)用。7 易于自動(dòng)化分離與分析自動(dòng)完成。二、色譜法的缺點(diǎn)對(duì)所分析對(duì)象的鑒別力是較差的，一般來(lái)說(shuō)色譜的定性分析是靠保留值定性，但在一定的色譜條件下，一個(gè)保留

12、值可能對(duì)應(yīng)多個(gè)化合物。第二章 吸附色譜 第一節(jié) 概述色譜法仍是植物成分分離分析的一種重要手段。中草藥：有效成分，如生物堿、強(qiáng)心苷、黃酮、皂苷等，此外還含有大量的其他成分，這些成分隨藥用部位、產(chǎn)地和采收季節(jié)的差異而變化。吸附色譜法，是指用吸附劑作固定相，利用被分析組分對(duì)吸附劑表面吸附能力的差異和在流動(dòng)相中溶解度的差異來(lái)進(jìn)行分離分析的方法。吸附劑一般是一些多孔物質(zhì)，具有較大的比表面積，在其表面有許多吸附中心。吸附劑之所以具有吸附作用，主要就是因?yàn)槠浔砻娴奈街行?，吸附中心的多少及其吸附能力的?qiáng)弱直接影響吸附劑的性能。吸附色譜通常采用的吸附劑有：硅膠、氧化鋁、聚酰胺和活性炭等。 第二節(jié) 吸附劑一、氧

13、化鋁 色譜用氧化鋁是由氫氧化鋁于400 一500 灼燒而成的，因制備方法和處理方法的差別，有堿性、中性和酸性三種，其中中性氧化鋁使用最多。堿性氧化鋁（pH9-10 ）適用于堿性（如生物堿）和中性化合物的分離。中性氧化鋁( pH 7.5 ）適用于分離生物堿、揮發(fā)油、萜類(lèi)、甾體以及在酸、堿中不穩(wěn)定的苷類(lèi)、酯、內(nèi)酯等化合物。凡是在酸、堿性氧化鋁上能分離的化合物，中性氧化鋁也都能分離。因此，中性氧化鋁的用途極廣。色譜前，首先要選擇適當(dāng)活性的氧化鋁，若已準(zhǔn)備好的氧化鋁不符合實(shí)驗(yàn)要使之含水量提高以降低活性或加入含水量較低的氧化鋁來(lái)提高活性。 用氧化鋁作吸附劑進(jìn)行色譜分析時(shí)應(yīng)注意的是：有些化合物如黃酮類(lèi)、三

14、萜酸能與氧化相結(jié)合，有些化合物在氧化鋁上會(huì)發(fā)生一些如異構(gòu)化、氧化、皂化、水合以及脫水反立這些情況下都不能采用氧化鋁作吸附劑。二、硅膠 硅膠通常用SiO2 xH2O 表示，是最常見(jiàn)的吸附劑，約90以上的分離工作都可采用硅膠。 硅膠是具有硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面有許多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是使硅膠具有吸附力的活性基團(tuán)，它能與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵或發(fā)生其他形式的相互作用。被分析物質(zhì)由于極性和不飽和程度不同，和硅醇基相互作用的程度也不同而得以分離。水能與硅膠表面羥基結(jié)合成水合硅醇基而使其失去活性。但將硅膠加熱到100 左右，水能可逆地被除去，故將此水稱(chēng)為“自由水”。同氧化鋁一樣，硅膠的活性與

15、含水量有關(guān)（見(jiàn)表），含水量高，活度級(jí)數(shù)高，吸附力弱。若“自由水”含量達(dá)17 以上，則吸附能力極低。若將硅膠在105 -110 加熱30min ，則硅膠吸附力增強(qiáng)，這一過(guò)程稱(chēng)為“活化”。氧化鋁和硅膠含水量與活性的比較硅膠含水量/%活性級(jí)氧化鋁含水量/%硅膠含水量/%活性級(jí)氧化鋁含水量/%002510533815156如果將硅膠加熱至500 ，由于硅膠結(jié)構(gòu)內(nèi)的水（結(jié)構(gòu)水）不可逆地失去使硅醇基結(jié)構(gòu)變成硅氧烷結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其吸附能力顯著下降。失去活性的硅膠含有一定量的水分，可用于分離色素，但其機(jī)理是基于分配作用。有時(shí)硅膠色譜具有吸附色譜和分配色譜的雙重性質(zhì)，甚至還有極弱的離子交換作用。硅膠具微酸性，適

16、于分離酸性和中性物質(zhì)，如酚類(lèi)、醛類(lèi)、生物堿、氨基酸、甾體及萜類(lèi)等。硅膠的分離效率與其粒度、孔徑及表面積等幾何結(jié)構(gòu)有關(guān)。硅膠粒度越小，均勻性越好，分離效率越高；硅膠表面積越大，則與樣品之間的相互作用越強(qiáng)，即吸附力越強(qiáng)。硅膠的優(yōu)點(diǎn)在于不像氧化鋁那樣有時(shí)會(huì)與樣品發(fā)生副反應(yīng)，但硅膠的分離效率有時(shí)比氧化鋁差，對(duì)雜質(zhì)的吸附能力也弱。與氧化鋁類(lèi)似，不同規(guī)格的硅膠都有商品出售，如硅膠G ，表示含有粘合劑鍛石膏，此類(lèi)硅膠用途較廣，可以分離許多有機(jī)化合物；硅膠CMC ，表示含有粘合劑羧甲基纖維素鈉( CMC 一Na ) ；硅膠HF254 ，表示不含粘合劑而含有熒光劑，此外還有硅膠GF254 和硅膠HF254 +

17、365 等。三、聚酰胺聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子物質(zhì)。色譜常用的是聚己內(nèi)酰胺，其商品名為錦綸、尼龍-6 、卡普隆等。 色譜用聚酰胺粉是白色多孔的非晶型粉末，不溶于水和一般有機(jī)溶劑，易溶于濃礦酸、酚、甲酸。聚酰胺分子內(nèi)存在著很多酰胺基，可與酚、酸、硝基化合物類(lèi)等形成氫鍵，因而產(chǎn)生吸附作用。由于聚酰胺與這些化合物形成氫鍵的能力不同，吸附能力也就不同，從而使各種化合物得到分離。一般來(lái)說(shuō)，能形成氫鍵基團(tuán)較多的物質(zhì)，吸附能力較強(qiáng)；鄰位基團(tuán)間能形成分子內(nèi)氫鍵者吸附力減弱；芳香核具有較多共扼鍵時(shí)，吸附能力增強(qiáng)。聚酰胺可分離極性和非極性物質(zhì)，如黃酮體、酚類(lèi)、醒類(lèi)、有機(jī)酸、生物堿、萜類(lèi)、甾體、苷類(lèi)、糖類(lèi)、氨

18、基酸衍生物、核苷類(lèi)等。尤其是對(duì)黃酮體、酚類(lèi)等物質(zhì)的分離，遠(yuǎn)比其他方法優(yōu)越。聚酰胺薄膜色譜在植物成分分離分析方面應(yīng)用非常廣泛。色譜用聚酰胺薄膜已有商品出售。四、活性炭色譜用活性炭一般分為三類(lèi)：（ 1 ）粉末狀活性炭：該類(lèi)活性炭顆粒極細(xì)，呈粉末狀，其比表面積特別大，因此吸附力和吸附量也大，是活性炭中吸附力最強(qiáng)的一類(lèi)。但由于其顆粒太細(xì)，在色譜過(guò)程中流速極慢，需加壓或減壓操作。( 2 ）顆粒狀活性炭：顆粒較前者為大，比表面積相對(duì)減小，吸附力及吸附量也較前者減弱。但在色譜中流速易于控制，勿需加壓或減壓操作。( 3 ）錦綸-活性炭：以錦綸為粘合劑，將粉末狀活性炭制成顆粒。比表面積介于顆粒狀活性炭和粉末狀活

19、性炭之間，但其吸附力較二者皆弱。用其分離酸性和堿性氨基酸可取得很好的效果。 活性炭主要用于分離水溶性物質(zhì)如氨基酸、糖類(lèi)及某些苷類(lèi)?；钚蕴吭谒芤褐械奈搅ψ顝?qiáng)，在有機(jī)溶劑中吸附力較弱。在一定條件下，對(duì)不同物質(zhì)的吸附力也不一樣。第三節(jié) 色譜技術(shù)與應(yīng)用實(shí)例 色譜法的形式和機(jī)理是多種多樣的。前面敘述了各類(lèi)吸附劑和以這些吸附劑作為固定相進(jìn)行的色譜法，其機(jī)理均基于吸附和解吸作用。為了更好地運(yùn)用色譜技術(shù)，簡(jiǎn)單地討論一下吸附色譜過(guò)程是必要的。一、色譜過(guò)程 以吸附柱色譜法為例，其操作及色譜過(guò)程如圖所示。把含有A 、B 兩組分的樣品加到色譜柱的頂端，A、B 均被吸附到固定相上，然后用適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相沖洗。當(dāng)流動(dòng)相流

20、過(guò)時(shí)，如此在色譜柱上不斷地發(fā)生吸附、解吸、再吸附、再解吸 的過(guò)程。若兩種物質(zhì)的理化性質(zhì)存在著微小的差異，則在吸附劑表面的吸附能力也存在微小的差異，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的重復(fù)，微小的差異積累起來(lái)變成了大的差異，其結(jié)果就是吸附能力弱的B 組分先從色譜柱中流出，吸附能力強(qiáng)的A 組分后流出色譜柱，從而使兩組分得以分離。ttSBABABAA 1345色譜過(guò)程示意圖二、吸附平衡吸附過(guò)程是樣品中各組分分子（X ）與流動(dòng)相分子（Y ）爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心的過(guò)程。吸附平衡可表示為：式中：m 代表移動(dòng)相；n 為配平常數(shù)；a 代表吸附劑。吸附平衡常數(shù)K 又稱(chēng)為吸附系數(shù)，可表示為 :吸附系數(shù)與吸附劑的活性、組分的性質(zhì)和流動(dòng)

21、相的性質(zhì)有關(guān)。在吸附色譜中吸附系數(shù)不等是組分分離的前提。對(duì)于一個(gè)混合物的分離，要尋找合適的色譜條件，主要就是選擇合適的吸附劑和流動(dòng)相（展開(kāi)劑）。三、吸附劑及其選擇一個(gè)合適的吸附劑，必須同時(shí)滿(mǎn)足下列要求： 表面積大，內(nèi)部是多孔的顆粒狀或纖維狀 的固體物質(zhì)； 在展開(kāi)劑中不溶，對(duì)展開(kāi)劑和樣品成分不起破壞或分解作用； 在溶液中能吸附樣品成分，吸附后又容易用溶劑把樣品組分從其表面解吸下來(lái)（吸附劑應(yīng)具有可逆的吸附性）； 最好是白色的固體，以便于觀(guān)察色譜結(jié)果。 在實(shí)際工作中選擇吸附劑主要是依據(jù)樣品組分的性質(zhì)，即它們的溶解度（水溶或脂溶）、酸堿性、極性以及是否與吸附劑發(fā)生化學(xué)變化等。下面以吸附薄層色譜為例分別

22、加以討論。1. 組分的溶解度實(shí)踐證明，不論是水溶性的糖、氨基酸還是脂溶性的脂肪油、揮發(fā)油、生物堿、甾類(lèi)等都可在吸附薄層上分開(kāi)，所以任何類(lèi)型的化合物都可首先考慮試用硅膠和氧化鋁。水溶性的化合物如果不能得到較好分離時(shí)，可試用纖維素或硅藻土（屬分配薄層）；脂溶性化合物如果不能得到較好分離時(shí)，可試用反相分配薄層。2 組分的酸堿性 硅膠略帶酸性，適用于酸性和中性物質(zhì)的分離；而堿性物質(zhì)則能與硅膠作用，展開(kāi)時(shí)易被吸附于原點(diǎn)不動(dòng)或得出拖尾的斑點(diǎn)而導(dǎo)致分離效果很差。反之，氧化鋁略帶堿性，適用于堿性和中性物質(zhì)的分離，而酸性物質(zhì)因與其吸附得較牢而難以得到較好的分離效果。因此，也有把硅膠和氧化鋁按近于1 : 1 的量

23、摻和在一起使用，也有在制備硅膠板時(shí)加入稀堿溶液或在制備氧化鋁板時(shí)加入稀酸溶液，或用酸性的或堿性的展開(kāi)劑展開(kāi)，以調(diào)節(jié)各自的酸堿性。3. 組分的極性組分的極性取決于其分子中所含官能團(tuán)的極性和分子結(jié)構(gòu)，物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，其極性也不同，在吸附劑表面的吸附力也不同。通常極性大的物質(zhì)吸附能力也強(qiáng)。常見(jiàn)化合物的極性（吸附能力）有下列順序：烷烴烯烴醚硝基化合物二甲胺酯酮醛硫醇胺酰胺醇酚羧酸。一般而言： 飽和碳?xì)浠衔餅榉菢O性化合物，一般不被吸附劑吸附； 不飽和化合物比飽和化合物的吸附力強(qiáng)，雙鍵數(shù)多，吸附力增強(qiáng)； 分子中基團(tuán)的極性越大、極性基團(tuán)數(shù)越多，整個(gè)分子極性越大； 分子中取代基的空間排列影響吸附能力，例如:

24、羥基處于能形成分子內(nèi)氫鍵的位置時(shí)，其吸附能力降低。 由此可見(jiàn)，含雙鍵、三鍵的烴比飽和烴容易被吸附，含羥基、羧基的化合物比烴和醚容易被吸附，因此有些化合物若含有很容易被吸附的基團(tuán)，就有可能在硅膠和氧化鋁薄層上吸附得太牢而得不到分離。例如： 黃酮（含多個(gè)酚羥基）有時(shí)就不宜用硅膠和氧化鋁，而宜采用聚酰胺作吸附劑。4. 吸附劑對(duì)樣品的作用堿性氧化鋁作吸附劑時(shí)，有時(shí)會(huì)對(duì)被吸附的物質(zhì)產(chǎn)生不良的副反應(yīng)。例如：引起醛、酮的縮合、酯和內(nèi)酯的水解、醇羥基的脫水、乙酰糖的去乙?；?。四、流動(dòng)相（展開(kāi)劑）及其選擇在柱色譜中稱(chēng)為流動(dòng)相，在薄層色譜中稱(chēng)為展開(kāi)劑的，是一種溶劑系統(tǒng)，由單一或混合溶劑組成。以薄層色譜為例，它的

25、作用是在展開(kāi)后使樣品的各個(gè)組分在薄層上得到分離。吸附色譜過(guò)程實(shí)際上是組分的分子與展開(kāi)劑的分子競(jìng)爭(zhēng)占據(jù)吸附劑表面活性中心的過(guò)程，所以展開(kāi)劑的選擇應(yīng)同時(shí)考慮被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)、吸附劑的活性及展開(kāi)劑的極性三個(gè)因素。分離極性較強(qiáng)的組分，宜選用活性低（級(jí)別高）的吸附劑，以極性強(qiáng)的展開(kāi)劑展開(kāi)；分離極性較弱的組分時(shí)，宜選用活性高（級(jí)別低）的吸附劑，以極性較弱的展開(kāi)劑展開(kāi)；中等極性組分則采用中間條件進(jìn)行分離?？傊?，通過(guò)選擇吸附劑和展開(kāi)劑，調(diào)整待測(cè)組分的Rf 值在0.3 -0.6 為宜。單一溶劑流動(dòng)相的極性順序?yàn)椋菏兔循h(huán)己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烷苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸水。以單一溶

26、劑為流動(dòng)相（展開(kāi)劑）時(shí)，由于溶劑組成簡(jiǎn)單，因而分離重現(xiàn)性好，但往往難以得到滿(mǎn)意的分離，所以，在實(shí)際中常采用二元、三元甚至多元溶劑組分。多元混合流動(dòng)相（展開(kāi)劑）中不同的溶劑各起不同的作用。一般占比例大的溶劑往往起到溶解待測(cè)組分和分離的作用，占比例較小的溶劑則起到調(diào)整改善分離物質(zhì)的Rf 值等作用，有時(shí)還需加入少量酸、堿以使某些極性物質(zhì)的斑點(diǎn)集中，提高分離度。例如：在 環(huán)己烷:丙酮:二乙胺:水10 : 5 : 2 : 5 的混合溶劑系統(tǒng)中，水的極性最強(qiáng)，環(huán)己烷的極性較弱，它可以降低展開(kāi)劑的極性，調(diào)節(jié)Rf 值；丙酮可以混勻整個(gè)溶劑系統(tǒng)及降低展開(kāi)劑的粘度；少量二乙胺的加入可以控制調(diào)整展開(kāi)系統(tǒng)的pH 值，

27、使分離的斑點(diǎn)清晰集中，減少拖尾現(xiàn)象。五、操作方式 吸附色譜法按其操作方式可分為柱色譜法和薄層色譜法。色譜法創(chuàng)始之初（20 世紀(jì)）是以柱色譜的形式出現(xiàn)的，30 與40 年代相繼出現(xiàn)了薄層色譜與紙色譜。經(jīng)典的柱色譜法由于樣品容量大，主要用于制備分離，而薄層色譜法更適用于分離分析。1 柱色譜法 經(jīng)典的柱色譜法是將作為固定相的吸附劑裝在一根玻管柱中（柱長(zhǎng)一般從幾十厘米到上百厘米不等），從管頂加入樣品溶液，再?gòu)墓茼敿尤肓鲃?dòng)相。使流動(dòng)相從上往下流過(guò)而使各種成分分離并依次流出色譜柱的過(guò)程稱(chēng)為洗脫。在洗脫時(shí)，可在柱的下端依次收集洗脫液并進(jìn)行檢查，每一份洗脫液從幾毫升到幾十毫升甚至幾百毫升不等。整個(gè)分離過(guò)程需幾

28、小時(shí)甚至幾天才能完成。經(jīng)典柱色譜法主要用于分離和精制較大量的樣品，通常適用于幾十毫克到幾十克樣品的分離。 近幾十年來(lái)飛速發(fā)展的高效液相色譜法采用遠(yuǎn)小于經(jīng)典色譜法的色譜柱（柱長(zhǎng)5 -30cm ，柱內(nèi)徑0.2-0.5cm ) ，較細(xì)的固定相（粒徑5 一10m ) ，用高壓泵輸送流動(dòng)相，具有分離性能好、分析速度快、流出組分容易收集、可以在線(xiàn)檢測(cè)和儀器化等經(jīng)典色譜法所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。有關(guān)內(nèi)容將在第三章專(zhuān)門(mén)介紹，故此處不再涉及。1.1 色譜柱的選擇 色譜柱的裝置如圖1 -1 所示。其內(nèi)徑與柱長(zhǎng)的比例一般在1 : 10 -1 : 20 之間。有時(shí)為了獲得好的分離效果，可采用細(xì)長(zhǎng)的色譜柱；有時(shí)為了從溶液中吸

29、去某種成分或?yàn)V去不溶物以及在利用活性炭脫色時(shí)為濾去細(xì)微的活性炭顆粒，可采用較矮胖的色譜柱。1 .2 裝柱根據(jù)所采用吸附劑的不同，裝柱方法略有不同：1.2.1 氧化鋁 一般先準(zhǔn)確量取一定體積的溶劑（vo ) ，將色譜柱的活塞稍打開(kāi)，將溶劑滴入接受器中，同時(shí)將氧化鋁慢慢地加入，保持邊沉降邊添加的狀態(tài)，直至加完。氧化鋁加入速度不宜太快，否則將帶入空氣泡。必要時(shí)可以在色譜管外輕輕敲打振動(dòng)，使氧化鋁均勻下降，并有助于趕走氣泡。當(dāng)采用活性較高的氧化鋁進(jìn)行色譜時(shí)，更應(yīng)注意。待氧化鋁加完后，仍使溶劑流動(dòng)一定時(shí)間，然后將氧化鋁上面的溶劑全部滴入接受器，準(zhǔn)確量取接受器內(nèi)的溶劑量（V1）。 從V0 一V1 之差，就

30、可以知道氧化鋁內(nèi)包含的溶劑體積。這樣在色譜過(guò)程中，就可以掌握大致在什么時(shí)候開(kāi)始收集流出組分；當(dāng)變換溶劑的時(shí)候，就可以知道新?lián)Q溶劑大致在哪一流分開(kāi)始 氧化鋁的用量一般是樣品量20 -50 倍， 根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)而定。也就是1g樣品需要 20 -50g氧化鋁進(jìn)行色譜。氧化鋁對(duì)萜烯、倍半萜烯等的吸附力較弱，這時(shí)氧化鋁用量可增至樣品量的100 -200 倍，而且為了盡量減少這類(lèi)化合物在色譜柱中的擴(kuò)散，色譜過(guò)程不能有間歇。1.2.2 硅膠 由于硅膠多為多孔性物質(zhì)，一般采用濕法裝柱，即將硅膠混懸于裝柱溶劑中，不斷攪拌待空氣泡除去后，連同溶劑一起傾入色譜柱中。最好一次傾入，否則由于不同粒度大小的硅膠沉

31、降速度不一，硅膠柱將有明顯的分段，從而影響分離效果。一般硅膠吸附柱色譜，樣品與吸附劑的比例可為1:30 -1:60 較難分離者有時(shí)甚至可選1:500 -1:1000 。1.2.3 活性炭 因活性炭在水中的吸附力最強(qiáng)，一般在水中裝柱。色譜柱內(nèi)先加少量蒸餾水，再以玻璃纖維塞住底部，并除去玻璃纖維中的氣泡?；钚蕴恳哉麴s水浸泡1h 左右，不斷攪拌除去氣泡。然后倒入柱中，讓其自然沉降，裝至所需體積，備用。 粉末活性炭因流速太慢，需與硅藻土（1:1）混合后，再用蒸餾水調(diào)成糊狀裝柱。并且待樣品上柱后，在色譜管頂端連一有自動(dòng)控制的加壓泵或在色譜管下端連一減壓泵進(jìn)行色譜。1.2.4 聚酰胺 取聚酰胺粉以90-9

32、5乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入色譜柱中。用3-4 倍體積的90-95乙醇洗滌，洗至洗液透明并在蒸干后無(wú)殘?jiān)ɑ驑O少殘?jiān)?。再依次?-2.5 倍體積，質(zhì)量濃度為5的NaOH 水溶液、1 倍體積的蒸餾水、2-2 . 5 倍體積的10 醋酸水溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，備用。若用含水溶劑系統(tǒng)洗脫，常以水裝柱，方法同活性炭的裝柱。若用非極性溶劑系統(tǒng)洗脫時(shí)，常以溶劑組分中極性低的組分裝柱 若以氯仿裝柱，因其比重較大使聚酰胺粉浮在上面，加樣時(shí)應(yīng)將柱底端的氯仿層放出并立即加樣，加樣后頂端用棉花塞緊。在色譜柱關(guān)閉時(shí)，應(yīng)將頂端多余的氯仿液放出，否則，聚酰胺會(huì)浮起而攪亂層帶。1.3 加樣 一般將樣品溶

33、于有機(jī)溶劑中，輕輕注入已準(zhǔn)備好的色譜柱上，勿使色譜柱面受到擾動(dòng)，否則將影響色譜效果。如果樣品不易溶于開(kāi)始色譜使用的有機(jī)溶劑，那么先將樣品溶于易溶的、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，以少量的吸附劑拌勻，然后將有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈，再按上述裝柱法裝柱，將帶有樣品的吸附劑加在色譜柱中的吸附劑上面。1.4 洗脫 洗脫效果與吸附劑、被吸附物質(zhì)的性質(zhì)、溫度及溶劑的性質(zhì)和濃度有關(guān)。就溶劑而言，極性溶劑的洗脫能力較非極性溶劑大，所以逐步增加溶劑的極性，可使吸附在吸附劑上的不同化合物洗脫，達(dá)到分離目的。 常用混合溶劑作為過(guò)渡，開(kāi)始時(shí)逐漸地增加較大極性溶劑的比例（0-10% ) ，以后每次遞增（如10 % ) ，然后再更換較大極

34、性的溶劑。1.5 吸附劑的再生 用過(guò)的吸附劑經(jīng)適當(dāng)方法處理后，可以重復(fù)使用。1 . 5 . 1 氧化鋁 色譜分離后，除去氧化鋁柱上端含聚合物及帶有深顏色的氧化鋁，用甲醇、稀醋酸、氫氧化鈉溶液及水洗滌，再經(jīng)高溫活化后，可重復(fù)使用。為了使吸附在氧化鋁表面的有機(jī)物分解，高溫活化時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)?；罨?，氧化鋁的顏色比使用后的稍淡。一般來(lái)說(shuō)，氧化鋁可重復(fù)使用多次，重復(fù)次數(shù)隨色譜過(guò)程中有機(jī)物污染的程度而定。1.5.2 硅膠 由于硅膠對(duì)雜質(zhì)及色素吸附力差，因此回收操作比氧化鋁簡(jiǎn)單。一般可用乙醇或甲醇洗滌，或于索氏提取器中連續(xù)抽提除去雜質(zhì)，洗凈的硅膠待溶劑揮發(fā)除去后，烘干活化處理即可使用。 硅膠的再生也可用5

35、-10 倍體積，質(zhì)量濃度為1的氫氧化鈉煮沸0.5h，如仍不呈強(qiáng)堿性（以酚酞作指示劑），可追加適量質(zhì)量濃度為1的氫氧化鈉，趁熱過(guò)濾，以蒸餾水洗3 次，再以36 倍5 鹽酸煮沸0.5h ，以蒸餾水洗至中性，120 活化，過(guò)篩即得。1.5.3 聚酰胺 用過(guò)的聚酰胺粉，一般用5氫氧化鈉洗滌，洗到氫氧化鈉液顏色極淡為止。有時(shí)因某鞣質(zhì)與聚酰胺有不可逆吸附，用氫氧化鈉很難洗脫時(shí)，可用質(zhì)量濃度為5的氫氧化鈉在柱中浸泡。每天將柱中的氫氧化鈉液放出一次，并加人新的氫氧化鈉液浸泡，這樣浸泡洗滌一周后，鞣質(zhì)可基本洗完。然后用蒸餾水洗至pH8-9 ，再以2 倍量10 醋酸洗，最后以蒸餾水洗至中性，即可重復(fù)使用。1.5.

36、4 活性炭用過(guò)的活性炭可以用酸堿處理回收。因活性炭來(lái)源較易，價(jià)格便宜，一般不回收使用。2. 薄層色譜法 薄層色譜法是將作為固定相的吸附劑均勻地涂布于平面載板（玻璃板、塑料膜、鋁箔）的表面上，展開(kāi)劑借助毛細(xì)管作用流經(jīng)固定相，使組分分離并保留在固定相上，然后定位、顯色。根據(jù)斑點(diǎn)的位置，計(jì)算Rf 值可以進(jìn)行定性分析；根據(jù)斑點(diǎn)的峰面積（或峰高）可以進(jìn)行定量分析。薄層色譜法的優(yōu)點(diǎn)在于：所使用的固定相是一次性的，因此樣品的預(yù)處理比較簡(jiǎn)單；被分離物質(zhì)的性質(zhì)沒(méi)有限制，應(yīng)用范圍廣；固定相特別是流動(dòng)相選擇范圍寬，有利于不同性質(zhì)化合物的分離；在同一薄層板上可根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)選擇不同顯色劑或檢測(cè)方法進(jìn)行定性或定

37、量分析。正因?yàn)槿绱?，薄層色譜法自問(wèn)世以來(lái)就受到分析工作者的廣泛重視并已發(fā)展成為一般實(shí)驗(yàn)室必不可少的分離分析方法。薄層色譜的分離分析工作已涉及化學(xué)、化工、醫(yī)藥、臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、毒理學(xué)研究等各個(gè)領(lǐng)域。H2SO4 1 2 3 4 5 6UV 366 1 2 3 4 5 6 UV 254 1 2 3 4 5 6 1.比移值（retardation factor : Rf )Rf =L/LoRf =0Rf =1Rf =0-1 之間前沿 Lo原點(diǎn)L1 L2實(shí)際操作中： Rf =0.2-0.8 為宜最佳范圍是: Rf =0.3-0.52.1 制板 薄層板一般分為不含粘合劑的軟板及含粘合劑的硬板兩種

38、。前者系將吸附劑或載體直接在玻璃板上用干法涂成均勻的薄層，但軟板疏松，操作很不方便，目前很少使用。制備含粘合劑的硬板，必須先要制備固定相的勻漿，它是由吸附劑與固定相以一定的比例用水調(diào)和而成。由于固定相及粘合劑類(lèi)型不同，性能也不相同，常用的粘合劑有鍛石膏、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na ）和某些聚合物如聚丙烯酸等。 薄層所用的玻璃板，除另有規(guī)定外，一般為520cm 、1020cm或2020 cm的2mm厚的玻璃板。為了能使吸附劑均勻地涂布，要求板面平整、潔凈。然后用手動(dòng)或自動(dòng)涂布器將已調(diào)制好的固定相均勻地涂鋪在玻璃板上。手動(dòng)涂布器常因推進(jìn)速度的不同，使厚度不均勻，因此最好采用自動(dòng)涂布器。鋪好的薄層

39、板應(yīng)先晾干，再在105-110 活化?；罨瘯r(shí)間為0.5-1h ，冷卻后即可使用，也可保存于干燥器中備用。有些薄層板鋪好后陰干即可使用，有些薄層板則需要保存在一定濕度下才能獲得較好的分離效果，如聚酰胺薄層板。 2.2 點(diǎn)樣 溶解樣品的溶劑，對(duì)點(diǎn)樣非常重要。盡量避免用水，因?yàn)樗芤喊唿c(diǎn)容易擴(kuò)散，且不易揮發(fā)。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發(fā)性溶劑，因?yàn)辄c(diǎn)樣后它們能迅速揮發(fā)，可減少色斑的擴(kuò)散。對(duì)水溶性樣品，采取先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。點(diǎn)樣量多少視薄層的性能及顯色劑的靈敏度等而定。一般是數(shù)微克至幾十微克。在檢測(cè)器靈敏度足夠時(shí)，應(yīng)降低點(diǎn)樣量，以減少拖尾。 點(diǎn)樣的量器為管口平整的點(diǎn)樣毛細(xì)管

40、或平口的微量注射器。吸取一定量樣品溶液，輕輕接觸于薄層的點(diǎn)樣線(xiàn)上。當(dāng)溶液稀時(shí)，反復(fù)點(diǎn)幾次，每次點(diǎn)干后再點(diǎn)，溶劑應(yīng)迅速揮去，否則造成樣斑擴(kuò)散而影響分離效果。原點(diǎn)面積越刁、越好，原點(diǎn)擴(kuò)散直徑以不超過(guò)2-3 mm為宜。各點(diǎn)距離為1-2cm 。如在空氣中點(diǎn)樣以不超過(guò)10 min 為宜，以免吸附劑在空氣中吸濕而降低活度。2.3 展開(kāi)根據(jù)薄層板的形狀、性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)恼归_(kāi)方式。一般來(lái)說(shuō)，軟板常選用近水平展開(kāi)方式，而硬板常選用上行法展開(kāi)，對(duì)于復(fù)雜組分的分離常常采用雙向展開(kāi)、多次展開(kāi)等其他展開(kāi)方式。多次展開(kāi)可以采用同一種展開(kāi)劑，但這樣做只是增加了展開(kāi)距離。另一種方式是為了分離不同極性的組分而采用不同極性的展開(kāi)系

41、統(tǒng)以達(dá)到增加分離度的目的。通常以揮發(fā)性大、易除去的溶劑系統(tǒng)為第尸展開(kāi)系統(tǒng)。此外，還有徑向展開(kāi)、下行法展開(kāi)等多種展開(kāi)方式。展開(kāi)劑的蒸氣飽和程度影響樣品的色譜行為，尤其在使用混合溶劑時(shí)更為突出。在展開(kāi)過(guò)程中極性較弱、沸點(diǎn)較低的溶劑在薄層板邊緣容易揮發(fā)，致使邊緣部分的展開(kāi)劑中極性溶劑的比例增大，使R ，值相對(duì)變大。同一物質(zhì)在同一薄層板上出現(xiàn)中間部分的Rf 燮嘩芝鯉魚(yú)道么連旦那象稱(chēng)塑婪妙返，若在展開(kāi)前將展開(kāi)槽與薄層板先用展開(kāi)劑蒸氣飽和，然后再展開(kāi)，邊緣效應(yīng)即可消除。所謂飽和就是在槽內(nèi)倒入展開(kāi)劑，或是在槽的四壁貼濾紙條，使濾紙條浸潤(rùn)展開(kāi)劑，蓋好蓋子，待槽內(nèi)的空間被展開(kāi)劑的蒸氣完全飽和后才進(jìn)行展開(kāi)。展開(kāi)劑的蒸氣飽和程度影響樣品的色譜行為，尤其在使用混合溶劑時(shí)更為突出。在展開(kāi)過(guò)程中極性較弱、沸點(diǎn)較低的溶劑在薄層板邊緣容易揮發(fā)，致使邊緣部分的展開(kāi)劑中極性溶劑的比例增大，使R ，值相對(duì)變大。同一物質(zhì)在同一薄層板上出現(xiàn)中間部分的Rf 燮嘩芝鯉魚(yú)道么連旦那象稱(chēng)塑婪妙返，若在展開(kāi)前將展開(kāi)槽與薄層板先用展開(kāi)劑蒸氣飽和，然后再展開(kāi)，邊緣效應(yīng)即可消除。所謂飽和就是在槽內(nèi)倒入展開(kāi)劑，或是在槽的四壁貼濾紙條，使濾紙條浸潤(rùn)展開(kāi)劑，蓋好蓋子，待槽內(nèi)的空間被展開(kāi)劑的蒸氣完全飽和后才進(jìn)行展開(kāi)。六、定性與定量分析1 定性分析1 . 1 比移值 比