北京大學生物顯微鏡課件

1、特殊生物顯微鏡的原理與使用北京大學細胞生物學實驗室主要內容暗視野顯微鏡相差顯微鏡偏光顯微鏡微分干涉顯微鏡熒光顯微鏡激光共焦掃描顯微鏡1.1 原理 丁達爾現(xiàn)象：在日常生活中，室內飛揚的微?；覊m是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵便粒粒可見了，這就是微粒發(fā)光。 暗視野顯微鏡就是利用微粒發(fā)光原理設計的。1.2 結構特點 使用中央遮光板或暗視野聚光器（常用的是拋物面聚光器），使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上，標本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內，因而整個視野是黑暗的。暗場顯微鏡原理1.3成像特點及優(yōu)缺

2、點 在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細微結構。但被檢物體為非均質時，并大于12波長，則各級衍射光線同時進入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構造。 一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結構，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。1.4 應用：微小粒子、細菌形態(tài)、細菌記數(shù)，透明標本觀察等。1.5 暗場顯微鏡的要求要求載玻片和蓋玻片必須無疵痕和灰塵物鏡前透鏡必須清潔無塵載玻片和蓋玻片厚度必須絕對符合要求1.6暗場觀察方式調節(jié)

3、(1)換上暗場聚光鏡（干燥系或油浸系）并在聚光鏡透鏡上表面滴上鏡頭油。向上緩慢調升聚光鏡，使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場光闌適當縮小，用10X物鏡找到被檢物體，同時在視場中看到視場光圈的輪廓象。上下緩慢調整聚光鏡，使視場光圈像清晰可見。(3)視場光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側兩個調節(jié)螺絲進行調整，再將其開大到相應位置。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。2.2結構特點 相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶

4、相位板的物鏡(通常標有PH的標記)代替普通物鏡，并帶有一個合軸調節(jié)用的望遠鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。2.3使用方法（1）相差裝置的調換安裝 卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍色光，使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。 （2）調焦 打開光源，旋轉集光器轉盤，將“0”對準標示孔，使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進行對光和調焦。 旋轉環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相

5、差物鏡相適應，如相差物鏡為40X時應用40X標示孔的光闌。（3）合鈾調整 拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡向內觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉動望遠鏡內筒使其上升，當對準焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。 （4）觀察 換回目鏡，按常規(guī)要領進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌。2.4用途 用于觀察組織培養(yǎng)中活細胞形態(tài)結構。活細胞無色透明，一般光鏡下不易分辨細胞輪廓及其結構，組織培養(yǎng)研究常用的是倒置相差顯微鏡。偏光顯微

6、鏡依據(jù)波動光學原理觀察和精密測定標本細節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質結構的一種顯微鏡分辨率可達0.04微米將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢,以鑒別某一物質具有單折射性(各向同性)或雙折射性(各向異性)一、偏振光與自然光1. 橫波的偏振性光矢量的振動方向總與光的傳播方向垂直，在垂直于光傳播方向的平面內, 可有不同的振動方向。v0HE只有橫波才有偏振現(xiàn)象2.線偏振光-光矢量只在某一固定的方向上振動。E播傳方向振動面3.自然光 普通光源發(fā)出的光,在垂直于傳播方向的平面上,所有可能方向的光矢量E 的振幅都相等。尋常光線(o光):遵守折射定律。對于晶體一切方向都具有相同的折射率，且在入射面內

7、傳播。非常光線(e光):不遵守折射定律。它的折射率隨方向而變化，并且不一定在入射面內傳播 。o光和e光都是線偏振光,且振動方向相互垂直二向色性：某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）對光振動有強烈的選擇性吸收能力，這種性質稱為二向色性。如電氣石晶體對自然光的某一振動方向上的光振動幾乎完全吸收，而垂直于該方向的光振動只稍微減弱后通過。旋光現(xiàn)象：線偏振光通過某些透明介質后，它的光振動方向將繞著光的傳播方向旋轉某一角度 的現(xiàn)象，稱為旋光現(xiàn)象。這種介質稱為旋光物質。如石英、糖、酒石酸鉀鈉等。偏振光經(jīng)過旋轉的檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光.偏振光經(jīng)過旋轉的檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢

8、偏器自然光線偏振光.偏振光經(jīng)過旋轉的檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光.偏振光經(jīng)過旋轉的檢偏器后光強發(fā)生變化.起偏器檢偏器自然光線偏振光.尼科爾棱鏡用途用于研究組織晶體物質及纖維等的光學性質微分干涉顯微鏡無色透明活體標本的細微結構圖象呈浮雕狀的立體感觀察效果更加逼真1 原理 通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強度相等的光束，光束載極近的兩點（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。2 特點可以使被檢物體產生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調節(jié)背景和物體的顏色變化而達到理想的效果。三、熒光顯微鏡一、原理 熒

9、光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內的熒光物質發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究。 熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。 什么是熒光：物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光冷光。即：物質吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光熒光

10、的種類： 自發(fā)熒光（固有熒光） 二次熒光熒光的性質： 吸收光，必需有激發(fā)光源 熒光波長激發(fā)波長（損失熱能） 熒光強度極小于激發(fā)光的強度 有不同程度的衰減 熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率二、熒光顯微鏡的種類： 透射式 落射式三、熒光顯微鏡主要部件 透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡 落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡熒光顯微鏡內部構造落射熒光顯微鏡光路圖透射熒光顯微鏡光路圖 WU WIBDUAL BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標本的單色和雙色觀察熒光光源 一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物

11、質都有一個產生最強熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質被激發(fā)光照射后，在極短時間內發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。四、使用方法 1打開燈源，超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮點。 2透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應的阻

12、斷濾片。 落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片雙色束分離器阻斷濾片的插塊。 3放置標本片，調焦后即可觀察。 使用中應注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷； 4高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。五、用途 1 觀察標本中的自發(fā)熒光物質或以熒光素染色或標記的細胞和結構 2 標本中的熒光物質在紫外線激發(fā)下產生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質在細胞和組織內的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質如神經(jīng)細胞和心肌細胞等內的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞內的維生素A呈綠色熒光，某些神經(jīng)內分泌細胞和神經(jīng)纖維內的單胺類物

13、質（兒茶酚胺、5羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。 3 細胞內的某些成分可與熒光素結合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進行細胞內DNA含量測定。 4 熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細胞化學研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標記抗體（一抗或二抗），用該標記抗體直接或間接地與細胞內的相應抗原結合，以檢測該抗原的存在與分布。激光掃描共焦顯微鏡技術工作原理：激光掃描顯微鏡是建立在光學顯微鏡及各種掃描顯微鏡基礎上的一種新型的掃描成象系統(tǒng)。利用聚焦的激光束在樣品表面掃描，同時利用光電檢測器件接收樣品反射光（或透射光），樣品結構的變化使反射光（或透射光）強度改變，因而使光電檢測器的輸出電流改變，經(jīng)信號處理，同步顯示在計算機屏幕上。 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片3. 增加側向分辨率4. 由于點對點掃描去除了雜散光的影響激光掃描共焦顯