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1、關(guān)于大腸桿菌染色體的制備第1頁,共9頁,2022年,5月20日,20點(diǎn)4分,星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握制備大腸桿菌染色體DNA的方法2.為 PCR擴(kuò)增目的基因的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備好模板第2頁,共9頁,2022年,5月20日,20點(diǎn)4分,星期三二、實(shí)驗(yàn)原理 大腸桿菌染色體DNA的制備首先收集對數(shù)生長期的細(xì)胞,然后用SDS破裂細(xì)胞,破細(xì)胞后,蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶消化、酚:氯仿除去,最后用乙醇沉淀核酸, RNA經(jīng)RNA酶消化除去,最終獲得了染色體DNA。第3頁,共9頁,2022年,5月20日,20點(diǎn)4分,星期三三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 1.菌株大腸桿菌DH5 2.儀器離心機(jī) 3.器皿玻璃離心管(10 mL)、移液管(10mL、
2、5mL)、微量取樣器、燒杯、玻璃棒、試管、三角瓶第4頁,共9頁,2022年,5月20日,20點(diǎn)4分,星期三 4.試劑(1)LB 完全肉湯培養(yǎng)液:1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、0.1%NaCl pH7.4。(2)SET 溶液:20%蔗糖、50mmol/L TrisHCl(pH7.6)、 50mmol/L EDTA。(3)20%SDS (4)酚:氯仿 (5)乙醇 (6)RNase溶液 (7)蛋白酶K 20mg/ml第5頁,共9頁,2022年,5月20日,20點(diǎn)4分,星期三四、實(shí)驗(yàn)步驟1.細(xì)胞收集已培養(yǎng)好的菌液收集于10mL的離心管中8000rpm離心5min去上清,留沉淀菌體第6頁,共9頁,2022年,5月20日,20點(diǎn)4分,星期三2.細(xì)胞裂解 沉淀菌體加入溶菌酶液(8 mg溶菌酶/1mLSET)加1mL20% SDS,使細(xì)胞裂解50L 20mg/mL蛋白酶,混勻5000rpm離心10min,棄沉淀 第7頁,共9頁,2022年,5月20日,20點(diǎn)4分,星期三3.DNA分離取上清加等體積的酚:氯仿,混勻3500rpm離心10 min取上清加入2倍體積的乙醇沉淀核酸3500rpm離心10 min棄上清加RNase溶液第8頁,共9頁,2022年,5月20日,2
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