第5講PCR技術(shù)基本原理及應(yīng)用(研究生課程)課件

1、第五章 PCR技術(shù)及原理（4學(xué)時(shí)）研究生課程Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize 第一節(jié) PCR的原理各種型號(hào)的PCR儀聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美國(guó)科學(xué)家穆利斯提出的一種體外DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)基礎(chǔ)：體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶（I II III）

2、拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶類SSB 引物dNTP Mg2+5 35Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 55一、PCR基本工作原理Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y = 2n (n 為循環(huán)次數(shù))PCR擴(kuò)增的平臺(tái)效應(yīng)（plateau effect） PCR擴(kuò)增的平臺(tái)效應(yīng)是不是cycles越多越好？模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+ 二、PCR體系基本組分三、PCR的反應(yīng)步驟變性95C延伸7

3、2C退火Tm-5C根據(jù)PCR反應(yīng)，能否設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)易PCR儀？簡(jiǎn)易的PCR反應(yīng)729455PCR循環(huán)變性退火延伸四、PCR技術(shù)的特點(diǎn)1、高度靈敏性；2、高度特異性；3、樣品廣泛的適應(yīng)性；4、操作簡(jiǎn)單。1、高度的靈敏性PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍； 30輪循環(huán)后，擴(kuò)增量達(dá)100萬(wàn)個(gè)拷貝（109拷貝）。2、高度的特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。所謂特異性：只擴(kuò)增引物之間的DNA?。?）在高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源性。（2）引物長(zhǎng)度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布

4、,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）3端為關(guān)鍵堿基；5端無(wú)嚴(yán)格限制。引物設(shè)計(jì)原則5端照抄，3端互補(bǔ)。引物的快速設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)舉例GCAATATGGCGATCGATCATACGTTACGGCATAATCCGACTA?如何快速設(shè)計(jì)1對(duì)引物，將紅色區(qū)域的DNA片段擴(kuò)增出來(lái)？3、適用樣品的廣泛性 既可是DNA，也可是RNA；既可是純化的，又可是粗制的；既可是新鮮組織，也可是陳舊樣品；既可是細(xì)胞(刮片細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、血細(xì)胞），又可是體液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。4、操作簡(jiǎn)便易行 PCR擴(kuò)增，只需數(shù)小時(shí)，就

5、可以擴(kuò)增出大量的DNA片段，可用于檢測(cè)基因組中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。 五、幾種重要的PCR衍生技術(shù)1、不對(duì)稱PCR技術(shù)；2、反向PCR技術(shù)；3、多重PCR技術(shù)；4、引物標(biāo)記PCR技術(shù)；5、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)。.1、不對(duì)稱PCR目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，其最佳比例一般是0.010.5M。 用途：制備核酸序列測(cè)定的模板；制備雜交探針；基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究。 高濃度引物低濃度引物2、反向PCR (reverse PCR) 用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的

6、未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶3、多重PCR在同一PCR體系中加入若干對(duì)PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。多重PCR常用來(lái)檢測(cè)同一基因的多個(gè)外顯子的缺失，或檢測(cè)缺失設(shè)置內(nèi)對(duì)照。用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物12341234DMD：人類肌營(yíng)養(yǎng)不良基因A：無(wú)外顯子8,12,17,19對(duì)應(yīng)條帶,說(shuō)明病人外顯子819缺失B：病人A中未擴(kuò)增外顯子帶的強(qiáng)度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴(kuò)增形式多重PCR檢測(cè)DMD基因缺失DMD基因外顯子缺

7、失的檢測(cè) 在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣本中多個(gè)不同序列的靶片段。4、LP-PCR（Labelled primers)利用同位素、熒光素等對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記, 用以直觀地檢測(cè)目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷?？赏瑫r(shí)檢測(cè)多種基因成分。病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4標(biāo)記引物觀察PCR產(chǎn)物5、錨定PCR（anchored PCR, A-PCR）錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對(duì)的3錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增。PCR的局限：需了解靶基因片段兩測(cè)的序列 對(duì)于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？cD

8、NA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3GGGG5CCCC 錨定引物3GGGG5CCCC3GGGGCCCC6、PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測(cè)探針信號(hào)可用于基因芯片的制作原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR，IsPCR）是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位和檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。7、原位PCR操作步驟1. 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2. PC

9、R擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3. 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)8、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探針，檢測(cè)RNA病毒、分析基因表達(dá)等。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式：以隨機(jī)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物。以oligo(dT)作為引物， mRNA3末端polyA尾與之互補(bǔ)。以人工合成的隨機(jī)序列六核苷酸混合物作為引物，進(jìn)行擴(kuò)增。reverse transcription逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增cDNART-PCR9、熒光定量 PCR（real-t

10、ime PCR)通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CEA基因拷貝數(shù) CEA 基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌，尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達(dá)， 因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄本，而在正常成人體內(nèi)極少表達(dá)。正常成人體內(nèi)CEA基因表達(dá)胃腸癌腫瘤組織中CEA基因的表達(dá)在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時(shí)，外周血中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。用靈敏、特異的技術(shù)檢測(cè)到這些腫瘤細(xì)胞中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本，是發(fā)現(xiàn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。10、基因的體外

11、誘變 11、增效PCR（booster PCR）當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問(wèn)題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增。消耗了引物和酶，而特異擴(kuò)增產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成產(chǎn)物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)1520個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充引物量，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。12、巢式PCR（nest PCR）此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR，與上面不同的是，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PC

12、R產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。13、差異顯示PCR（differential display ）一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)。DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學(xué)研究，是目前篩選基因表達(dá)差異最有效的方法。 差異顯示RT-PCR(Differential display RT-PCR)5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3Poly(A) RNA5 T12MN 3錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTT

13、TT 5變性5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5退火5 T12MN 3錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3M N TTTTTTTTTTTT 5延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3M N TTTTTTTTTTTT 55MNAAAAAAAAAAA 3變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C) 啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測(cè)序，同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后進(jìn)行非變性（中性）聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個(gè)核苷酸的改變即可造成DNA單鏈構(gòu)象的改變，進(jìn)而導(dǎo)致電泳速率變化，從而檢測(cè)出基因突變

14、。14、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR-SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）PCR-SSCP分析原理示意 - primer - 32P-dNTP摻入 PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物 變性 單鏈DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 自顯影 1.為正常 結(jié)果分析 2、4、5純合患者 3.為雜合子 . 解鏈構(gòu)像DNA原 理過(guò) 程PCR-SSCP過(guò)程用PCR-SSCP技術(shù)發(fā)現(xiàn)我第一例 LDH遺傳變異病例 病 例 21歲男性： LDH：75 U/L (參考范圍：110-240 U/L)其余指標(biāo)均正常在三年的調(diào)查期間，LDH活力始終處于較

15、低水平，在 48-85 U/L之間 經(jīng)排除其它原因，如血中的抑制劑的存在、藥物的影響等可能因素外，我們懷疑可能有遺傳性的LDH變異。根據(jù)計(jì)算紅細(xì)胞中H、M亞基的比值，初步斷定為H亞基變異，采用合成的7對(duì)引物，分別擴(kuò)增LDH基因中的7個(gè)外顯子，然后用SSCP電泳法與正常人對(duì)照，發(fā)現(xiàn)變異發(fā)生在外顯子4上，由此證明該病人的長(zhǎng)期低酶活力是有基因變異引起的。 LDH-A基因變異類型_變異位置 DNA 氨基酸置換 影 響A-171 CGA-TGA Arg-Ter 無(wú)義突變A-328 GAG-TAG Glu-Ter 無(wú)義突變A-81 GAC-AAC Asp-Asn 外顯子2丟失A-220 AAA-GAA L

16、ys-Glu 電荷變化A-314 CGT-TGT Arg-Cys 電荷變化A-20 插入C 移碼突變A-128 TGTTGT-TGT ValVal-Val 輔酶結(jié)合A-213 丟失2 bp (CT) 移碼突變A-251 丟失20 bp 移碼突變 LDH-B基因變異類型變異位置 DNA 氨基酸置換 影 響B(tài)-6 AAA-GAA Lys-Gly 電荷變化B-35 GCC-GAG Ala-Glu 輔酶結(jié)合B-103 8bp重復(fù) 移碼突變B-131 AGT-CGT Ser-Arg 輔酶結(jié)合B-139 丟失2 bp (TC) 移碼突變B-145 4bp重復(fù) 移碼突變B-147 TAT-TAG Tyr-T

17、er 無(wú)義突變B-171 CGC-CCC Arg-Pro 基質(zhì)結(jié)合B-172 TTT-GTT Phe-Val 基質(zhì)結(jié)合B-173 CGC-CAC Arg-His P軸的安定性B-176 ATG-TTG Met-Leu 分子穩(wěn)定性B-287 丟失1bp(C) 移碼突變B-320 GAT-GTT Asp-Val 電荷變化 六、PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用人類疾病的發(fā)生，常涉及到內(nèi)源基因的改變和外源基因的侵入。前者可引起各種遺傳性疾病或腫瘤；后者如細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等感染機(jī)體，把它們的基因也帶入人體。不論其致病是否由基因所致，也不管其基因是否整合到人體基因組中，只要病原體存在，機(jī)體就會(huì)有其核酸存在，因此

18、PCR及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展為臨床診斷提供了行之有效的方法。1. 目的基因的克隆2. 基因的體外突變3. DNA和RNA的微量分析4. DNA序列測(cè)定5. 基因突變分析大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因1、基因克隆55Bam H IBam H IBam H IBam H I2、基因檢測(cè)A內(nèi)源性病變基因正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)3、遺傳病的診斷 基因缺失、插入或置換等地中海貧血珠蛋白鏈合成不平衡A正常人病 人正常病人ASO探針?lè)ˋCTGASO探針正常病人PCR-ASO檢測(cè)基因點(diǎn)突變:主是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段,然后用人工合成的含突變位點(diǎn)的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交探

19、針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子 4、惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）PCR-RFLP法：限制性內(nèi)切酶Ras基因突變限制性內(nèi)切酶正常突變電泳HLA系統(tǒng)基因分型PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-SSP5、基因配型 PCR-SSP1 2 3 4 5 6 7 8PCR1 2 3 4 5 6 7 8引物特異性（序列特異性引物-PCR技術(shù) ）6、基因鑒定女性男性Y引物PCR男性 女性7、甲基化特異性MS-PCRDNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要部分，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起重要作用。如在一般正常的細(xì)胞中，基因調(diào)控區(qū)CpG島處于非甲基化狀態(tài)，而當(dāng)

20、細(xì)胞發(fā)生癌變后，這些區(qū)域往往呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增強(qiáng)子 結(jié)構(gòu)基因-GCGC-CAAT-TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列 將DNA先用亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ谆牟蛔?，隨后行引物特異性的PCR。在MS-PCR中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)為甲基化特異性的引物（primer），一對(duì)為非甲基化的引物（primer），進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物，最終可以確定研究DNA片段部位的甲基化情況。 Methylation specific PCR, MS-PCR模板甲基化處理：Na2SO3 C-U需設(shè)計(jì)

21、特異性甲基化引物G:C/A:U 3 GGACGTAGA5 甲基化引物 5-CCTGCATCT- GCGCTAGGC-33-GGACGTAGA-CGCGATCCG-5 5GCGCATGGC 3 3 AAACATAAA 5 非甲基化引物 5-UUTGUATUT-GCGCTAGGC-33-GGACGTAGA-AUGUGATUU-5 5TACACATAA 37、法醫(yī)學(xué)分析 個(gè)體識(shí)別、親緣鑒定方法：PCR-RFLP DNA遺傳指紋 PCR-ASO PCR-VNTR多態(tài)性 PCR-SSCP 線粒體DNA測(cè)序PCR-VNTR多態(tài)性檢測(cè)PCR；電泳檢測(cè)（VNTR：數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列 ）父 父 子 母DNA

22、 fragmentscompared afterelectrophoresisCrime sceneSuspect 1Suspect 2PCR 現(xiàn) 嫌1 嫌2 嫌38、DNA多態(tài)性DNA多態(tài)（DNA Polymorphism）： DNA區(qū)域中等位基因(或片段)存在兩種或兩種以上形式,對(duì)基因沒(méi)有影響,稱為DNA 多態(tài)。 群體中每個(gè)個(gè)體（體細(xì)胞）的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100500bp就有一個(gè)是不相同的，它們多位于內(nèi)含子序列中，表型并沒(méi)有改變，這種表現(xiàn)稱為DNA多態(tài)。除一卵雙生子外，沒(méi)有兩個(gè)個(gè)體的基因組DNA是完全相同的。 常用做遺傳分析中的標(biāo)記-遺傳標(biāo)記DNA分析中常用的多態(tài)性標(biāo)記有3類1）RFLP：稱限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性：短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3）單堿基多態(tài)性（SNP）：DNA單個(gè)核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。一、序列多態(tài)（或點(diǎn)多態(tài)）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 由于堿基的變異可能導(dǎo)致限制酶切點(diǎn)的消失或新的酶切點(diǎn)出現(xiàn)，從而引起不同個(gè)體的DNA在用同一限制酶