酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座培訓(xùn)課件

1、酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶工程簡介酶工程（Enzyme engineering）是指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和DNA重組技術(shù)改善自然酶的形成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，提高酶的催化活性、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。主要內(nèi)容：1 酶的制備和酶與細(xì)胞的固定化2 酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和放大3反應(yīng)條件的控制和優(yōu)化.第一節(jié) 概 述2酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶工程的分類化學(xué)酶工程：通過對酶的化學(xué)修飾或固定化處理，改善酶的性質(zhì)，提高酶的效率和降低成本，甚至通過化學(xué)合成法制造人工酶，也稱為初級酶工程；生物酶工程：用基因工程技術(shù)生產(chǎn)酶以及對酶基因進(jìn)行修飾或設(shè)計(jì)性能穩(wěn)定、具有新的生物活性及催化效率更高的酶，也稱為高級酶工程。3酶工

2、程醫(yī)學(xué)知識專題講座一、酶的定義酶是由生物體內(nèi)活細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物催化劑，按化學(xué)組成的不同主要分為核酸類酶（R酶）和蛋白質(zhì)類酶（P酶）。4酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座二、酶的分類與命名法1 習(xí)慣命名法底物名稱： 淀粉酶、蛋白酶催化反應(yīng)性質(zhì)：氧化酶、轉(zhuǎn)氨酶底物結(jié)合催化反應(yīng)性質(zhì)：膽固醇氧化酶、醇脫氫酶來源：心肌黃酶、含鐵酶缺點(diǎn)：無系統(tǒng)性，一酶數(shù)名或一名數(shù)酶。5酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座2 系統(tǒng)命名法與分類國際生化聯(lián)合會（IUB）酶學(xué)委會于1961年規(guī)定了酶的統(tǒng)一命名法及分類原則。系統(tǒng)命名法：酶的名稱由底物及反應(yīng)類型兩部分組成。六大類：氧化-還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶。6酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講

3、座7酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座三、酶的結(jié)構(gòu)和特性1 酶的結(jié)構(gòu)酶的組成成分單純酶僅由蛋白質(zhì)組成的酶。結(jié)合酶除蛋白質(zhì)外，還有非蛋白質(zhì)的成分。全酶=酶蛋白+輔因子輔因子有兩種：輔酶和輔基8酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座9酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座根據(jù)酶的聚合狀態(tài)，酶可以分為三類：單體酶寡聚酶多酶復(fù)合體10酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶的活性中心指酶分子中直接和底物結(jié)合，并和酶催化作用直接相關(guān)的部位。組成：由一些氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)組成。這些基團(tuán)在一級結(jié)構(gòu)上可能相聚很遠(yuǎn)，甚至可能不在一條肽鏈上，但在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。對于結(jié)合酶，輔因子常常是活性中心的組成部分。11酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶

4、活性中心的特點(diǎn)：活性中心在酶分子總體積中只占相當(dāng)小的部分（1-2%），相當(dāng)于2-3個(gè)氨基酸。都是酶分子表面的一個(gè)凹穴，有一定的大小和形狀，但不是剛性的，而具有一定的柔性?；钚灾行臑榉菢O性的微環(huán)境，有利于與底物結(jié)合。底物與酶通過形成較弱鍵力的次級相互作用并結(jié)合到酶的活性中心。酶的活性部位并不是和底物的幾何圖形正好吻合，而是在酶與底物結(jié)合的過程中，底物分子或酶分子或它們兩者的構(gòu)想同時(shí)發(fā)生一定變化后才能相互契合，這時(shí)催化基團(tuán)的位置也正好處于所催化底物的敏感化學(xué)鍵部位。12酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座2 酶的特性催化效率高專一性強(qiáng)反應(yīng)條件溫和催化活性受到調(diào)節(jié)和控制13酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座四、酶的來源酶作為

5、生物催化劑普遍存在于動物、植物和微生物中，可直接從生物體中分離提純。 酶的生產(chǎn)方法可分為提取法發(fā)酵法以及化學(xué)合成法。化學(xué)法仍在實(shí)驗(yàn)室階段；提取法是最早采用且沿用至今的方法，如從動植物組織液中提取胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶；發(fā)酵法是50年代以來酶生產(chǎn)的主要方法，如生成葡萄糖異構(gòu)酶和枯草芽孢桿菌蛋白酶等。14酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座五、酶促動力學(xué)六、酶的分離純化與酶的活力測定1 酶的分離純化細(xì)胞外酶和細(xì)胞內(nèi)酶在生物細(xì)胞內(nèi)除了目標(biāo)酶還有很多其他的酶，因此需要分離和純化的步驟。基本步驟：破碎細(xì)胞膜抽提純化15酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座比活力：純度的量度，指每毫克質(zhì)量的蛋白質(zhì)中所含的某種酶的催化活力，一般用單位/毫

6、克蛋白（U/mg蛋白質(zhì)表示）。酶的比活力越高，酶的純度也就越高。純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力產(chǎn)率%=每次總活力/第一次總活力16酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座2 酶的活力測定1個(gè)酶活力國際單位是指在特定條件下，1min內(nèi)生成1mol產(chǎn)物的酶量（或轉(zhuǎn)化1 mol 底物的酶量）。17酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座第二節(jié) 酶和細(xì)胞固定化18酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶固定化技術(shù)發(fā)展史20世紀(jì)60年代，以色列科學(xué)家發(fā)現(xiàn)酶的固定化現(xiàn)象。1969年，千畑一郎等將固定化氨基?；笐?yīng)用于生產(chǎn)L-氨基酸，開創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例；1971年召開的第一屆國際酶工程會議上，建議采用統(tǒng)一的英文名稱Immobilized

7、Enzyme；1973年，固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸。1986年，利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功。19酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座一、固定化酶的制備 固定化酶的定義： 固定化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。廣義的固定化酶包括：固定化輔酶；固定化細(xì)胞；固定化細(xì)胞器為了減少從微生物或者其他生物體中提取酶的麻煩，有時(shí)為了充分利用生物細(xì)胞的多酶系統(tǒng)，開發(fā)另外一種固定化催化劑的形式，固定化細(xì)胞。20酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座固定化酶的特點(diǎn) 具有生物催化

8、劑的功能，又有固相 催化劑的功能?？芍貜?fù)使用，降低成本；反應(yīng)后，酶底物產(chǎn)物易分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高。穩(wěn)定性提高，反復(fù)使用多次后，酶的活力無明顯下降；反應(yīng)條件易于控制，可以自動控制，節(jié)約勞動力。21酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座固定化酶的制備原則（1）必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心的構(gòu)象。（2）酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。酶的固定化既不影響酶的原有構(gòu)象，又能使固定化酶能有效回收貯藏，利于反復(fù)使用。（3）固定化應(yīng)有利于自動化、機(jī)械化操作。這要求用于固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，才能使之在制備過程中不易破壞或受損。（4）固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。（5）固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性

9、。在應(yīng)用過程中，所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。（6）固定化酶的成本適中。22酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶和細(xì)胞固定化方法 酶和細(xì)胞固定化方法 載體結(jié)合法 交聯(lián)法 包埋法 網(wǎng)格型 微囊型物理吸附法 離子結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法 熱處理（細(xì)胞）23酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶和細(xì)胞固定化模式24酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座結(jié)晶法使酶結(jié)晶從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法。載體是酶蛋白本身。對于活性低的酶，可以提高酶濃度和單位體積的活力。局限性：在重復(fù)使用中，酶有損耗。25酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座（ 1 ）吸附法通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。吸附法又可分為物理吸

10、附法和離子吸附法。 26酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座物理吸附法物理吸附法(physical adsorption)是通過非特異性物理吸附作用將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。包括范德華力、疏水相互作用、氫鍵。物理吸附法常用的載體：有機(jī)載體：纖維素、膠原、淀粉及面筋等；無機(jī)載體：活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。27酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座離子吸附法離子吸附法(ion adsorption)是通過離子鍵使酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體相結(jié)合的固定化方法。陰離子交換劑： DEAE-纖維素，DEAE-葡萄糖凝膠等陽離子交換劑： 羧甲基纖維素等此法固定的酶有葡

11、萄糖異構(gòu)酶、糖化酶、-淀粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。1969年最早用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化氨基酰化酶：使用多糖類陰離子交換劑DEAE-葡萄糖凝膠固定化。28酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座吸附法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，條件溫和，吸附劑可再生反復(fù)使用。吸附法的缺點(diǎn)：酶和載體的吸附力比較弱，容易在不適宜的pH、高鹽濃度、高底物濃度或高溫條件下解析脫落，易導(dǎo)致催化活力的喪失和污染反應(yīng)產(chǎn)物等后果。29酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座（ 2 ）包埋法包埋法（entrapment）是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型

12、?；驹恚簡误w和酶溶液混合，再借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，將酶固定于載體材料的網(wǎng)格或微囊中。30酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座 網(wǎng)格型：包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。將塊狀聚合形成的凝膠切成小塊，或直接包埋在珠狀聚合物中，后者可以使固定化酶機(jī)械強(qiáng)度提高10倍，并改進(jìn)酶的脫落的情況。常用的材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹脂等合成高分子物質(zhì)淀粉、明膠、膠原、海藻酸和角叉膠等天然高分子物質(zhì)。31酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座微囊型：包埋在高分子半透膜中。膜既能形成類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，又能阻止酶的脫落或直接與微囊外的環(huán)境接觸；小分子底物能迅速通過膜與酶作用，產(chǎn)物也能擴(kuò)散出來。32酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座制備方法：1 界面沉

13、淀法：利用高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度極低而形成膜將酶包埋。2 界面聚合法：將親水性單體和疏水性單體利用界面聚合的原理包埋酶的方法。3 纖維包埋法（二級乳化法）：酶溶液先在高聚物有機(jī)相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次級乳化液，當(dāng)有機(jī)高聚物溶液固化后，每個(gè)固體球內(nèi)包含多滴酶液。33酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座包埋法的優(yōu)點(diǎn)反應(yīng)條件溫和，不需要與酶的氨基酸殘基進(jìn)行反應(yīng)，不改變酶的結(jié)構(gòu)；酶回收率高；缺點(diǎn)：包埋時(shí)發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)，酶容易失活（微囊型），要要巧妙設(shè)計(jì)反應(yīng)條件。由于高分子網(wǎng)格的擴(kuò)散阻力，會改變固定化酶的動力學(xué)行為，降低酶活力。僅適用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。34酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座（

14、3 ）交聯(lián)法交聯(lián)法（cross-linking）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物等。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。35酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座 36酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座交聯(lián)法的特點(diǎn)反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶回收率比較低，但是降低交聯(lián)劑的濃度和縮短反應(yīng)的時(shí)間有利于固定化酶比活力的提高。交聯(lián)劑一般價(jià)格昂貴，所得到的固定化酶活力較低，不易成型，一般作為其他固定方法的輔助手段，如與吸附法和包埋法聯(lián)合使用，起到加固結(jié)合的作用。37酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座（

15、4 ）共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法(covalent binding）是將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。常用方法歸納起來有兩類：1 將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；2 在載體上連上一個(gè)雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。38酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)（1）酶蛋白N末端的-氨基或賴氨酸殘基的-氨基。（2）酶蛋白C末端的-羧基、天門冬氨酸殘基的-羧基以及谷氨酸殘基的-羧基。（3）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。（4）其他：半胱氨酸殘基的巰基；絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基；組氨酸殘基的咪唑基；色氨酸殘基的吲哚基。參加和載體共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)必須不是活性中心的基

16、團(tuán)，也不是維持酶蛋白空間結(jié)構(gòu)必須的基團(tuán)。39酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座共價(jià)結(jié)合載體的特點(diǎn)1 可以在溫和條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；2 具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和較大的表面積。常用的載體有：天然的高分子物質(zhì)：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、淀粉及其他衍生物；無機(jī)物：陶瓷、玻璃等；人工合成的高聚物：甲基丙烯酸共聚物、順丁烯二酸酐和乙烯的共聚物、氨基酸共聚物及聚苯乙烯等。40酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座載體活化的主要反應(yīng)重氮法疊氮法溴化氰法芳香烴化法41酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座重氮法重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團(tuán)通過共價(jià)鍵相連接而固定化的方法，是共價(jià)鍵法中使用最多的一種。常用的載體有多糖類的芳族氨基衍生物、氨基

17、酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。42酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座具有芳香族的水不溶性載體在稀鹽酸和亞硝酸鈉中進(jìn)行反應(yīng)，成為重氮鹽化合物，然后再與酶發(fā)生偶合反應(yīng)，得到固定化酶。酶蛋白中的游離氨基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸中的酚基參與此反應(yīng)。43酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座疊氮法即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)成固定化酶。含有羥基、羧基、羧甲基等基團(tuán)的載體都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交聯(lián)葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等都可用此法來固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纖維素疊氮法。44酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座45酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座溴化氰法即用溴化氰將含有羥基

18、的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，制成固定化酶。任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來活化。46酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座47酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座烷基化和芳基化法以鹵素為功能團(tuán)的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應(yīng)而使酶固定化。此法常用的載體有鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。48酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座49酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座對于無機(jī)載體，可用直接法和涂層法（用活化物的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂層）。50酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座共價(jià)結(jié)合法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：共價(jià)鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)牢固，即使用高

19、濃度底物溶液或鹽溶液，也不會使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)：載體活化的難度較大，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化。51酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座52酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座二 輔酶和輔基的固定化53酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座輔酶固定化原因1）輔酶因子中特殊化學(xué)基團(tuán)參與催化反應(yīng)；2）輔酶因子流失，且不能再生；3）輔酶因子價(jià)格昂貴；工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生。54酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座輔酶固定化的方法：1. 固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕?/p>

20、學(xué)修飾后固定在超濾器中。2. 輔酶固定化必須解決輔酶在多個(gè)酶之間傳遞的障礙。 55酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座56酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座需要輔酶的酶反應(yīng)體系：1 輔酶與酶均不固定化；2 輔酶不固定而酶固定；3 輔酶固定而酶不固定；4 輔酶和酶分別固定；5 輔酶和酶共固定；6 輔酶與酶分子偶聯(lián)形成輔酶-酶復(fù)合物的反應(yīng)系統(tǒng)（輔酶分子量小，難以截留）反應(yīng)的擴(kuò)散阻力大57酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座輔酶固定化的形式：58酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座三 固定化細(xì)胞的制備固定化細(xì)胞的定義 將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)。 固定化細(xì)胞就是被限制自由移動的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)因素的約束或限制在一定的

21、空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。59酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座 固定化細(xì)胞的特點(diǎn) 有細(xì)胞特性，生物催化劑功能，固相催化劑特點(diǎn)。 優(yōu)點(diǎn)：無須進(jìn)行酶的分離純化保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高比固定化酶穩(wěn)定性高細(xì)胞內(nèi)酶輔助因子可再生細(xì)胞本身含多酶體系抗污染能力強(qiáng)60酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座3 固定化細(xì)胞生理學(xué)特性如上圖所示：第一類一般只適用于一種酶催化的反應(yīng)。第二類由一種輔酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。第三類適用與多酶反應(yīng)，特別是需要輔酶的反應(yīng)。61酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座4 固定化細(xì)胞的制備技術(shù)理想的固定化細(xì)胞的制備方法，應(yīng)該具有如下特點(diǎn)： 1.能夠控制固定化細(xì)胞的大小和孔隙度。

22、2. 方法簡單、易行，應(yīng)盡可能少損傷細(xì)胞。 3.具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。 4.單位體積的固定化細(xì)胞應(yīng)該擁有盡可能多的細(xì)胞。62酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座 載體結(jié)合法 是將細(xì)胞懸液直接與水不溶性的載體 相結(jié)合的固定化方法。涉及到酶或細(xì)胞的化學(xué)修飾，可能引起細(xì)胞破壞，應(yīng)盡量在溫和的條件下進(jìn)行反應(yīng)。由于在使用中細(xì)胞間、細(xì)胞和載體之間的鍵不容易被破壞，所以操作的穩(wěn)定性高。 63酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座包埋法 將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)的技術(shù)。實(shí)際使用中限制酶活力的因素較多，且只適合于小分子底物。適合用于固定活細(xì)胞。64酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座 交聯(lián)法 用多功能試劑對細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)的固 定化方法。沒有良好的

23、機(jī)械強(qiáng)度，不合適實(shí)際使用，細(xì)胞濃度較高。 無載體法 靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞的技術(shù)。65酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座選擇性熱變性法專用于細(xì)胞固定化。是將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臏囟认绿幚硎辜?xì)胞膜蛋白變性，但不使酶變性而使酶固定于細(xì)胞內(nèi)的方法。66酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座5 固定化活細(xì)胞將活細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法。67酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座無需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時(shí)大大降低了成本；保持了酶的原始狀態(tài)，比固定化酶的穩(wěn)定性更高，對污染的抵抗力更強(qiáng)；細(xì)胞本身含多酶系統(tǒng)，可催化一系列反應(yīng)，且不需添加輔助因子；細(xì)胞生長停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等。固定化活細(xì)胞的優(yōu)越性68酶工程醫(yī)學(xué)知

24、識專題講座缺點(diǎn)必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度；必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對目的酶的分解；胞內(nèi)多酶的存在，會形成副產(chǎn)物；載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會造成底物滲透與擴(kuò)散的障礙等。69酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座制備方法固定化完整細(xì)胞的方法很多，但是沒有一種理想的通用方法；對于特定的應(yīng)用，必須找到價(jià)格低廉、簡便的方法，高活力保留和操作穩(wěn)定性是評價(jià)固定化生物催化劑的先決條件。70酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座四、固定化酶的形狀與性質(zhì)固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒狀、纖維狀、酶膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)，它和纖維狀主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行

25、批式攪拌反應(yīng)。71酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座固定化酶的性質(zhì)酶活力的變化固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：酶活性中心的重要氨基酸殘基被載體結(jié)合；高級結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的改變；空間位阻的影響；內(nèi)擴(kuò)散阻力；半透膜的隔離。個(gè)別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高。72酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶穩(wěn)定性的變化操作穩(wěn)定性：體內(nèi)半衰期貯藏穩(wěn)定性：低溫放置熱穩(wěn)定性：耐熱性提高對蛋白酶的穩(wěn)定性：空間位阻其他：對有機(jī)溶劑、pH、酶抑制劑等的穩(wěn)定性均有提高。73酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶學(xué)特性的變化底物特異性：對高分子底物的活性明顯下降；最適pH：最適pH和pH曲線常會發(fā)生偏移；最適溫度：多數(shù)較游離酶高；動力學(xué)

26、常數(shù)：Km均增大，增大幅度視情況而定；最大反應(yīng)速度：與游離酶大多數(shù)是相同或相近。74酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座五 評價(jià)固定化酶生物催化劑的指標(biāo)1 固定化酶(細(xì)胞）的活力定義：-固定化酶細(xì)胞催化策一特定化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)的速度來表示。固定化酶（細(xì)胞）的單位可定義為每毫克干重固定化酶（細(xì)胞）每分鐘轉(zhuǎn)化底物（或生產(chǎn)產(chǎn)物）的量。mol.min-1 分批測定法 連續(xù)測定法75酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座2 偶聯(lián)率及相對活力的測定固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（細(xì)胞）所顯示的活力占被固定的等當(dāng)量游離酶(細(xì)胞）總活力的百分?jǐn)?shù)。76酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座偶聯(lián)率1時(shí)表示

27、反應(yīng)控制好，固定化酶失活不明顯；偶聯(lián)率時(shí)，擴(kuò)散限制對酶活力有影響；偶聯(lián)率1時(shí)有細(xì)胞分裂或從載體排除抑制劑等原因。77酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座3 固定化酶（細(xì)胞）的半衰期操作穩(wěn)定性是影響固定化酶（細(xì)胞) 實(shí)用的關(guān)鍵因素半衰期-在連續(xù)測定條件下，固定化酶（細(xì)胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷時(shí)間，以t1/2表示。半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)78酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座固定化酶（細(xì)胞）活力隨時(shí)間成指數(shù)關(guān)系，半衰期：KD=-2.303/tlg(E/E0)E/E0 是時(shí)間t后酶活力殘留的百分?jǐn)?shù)79酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座一 酶反應(yīng)器80酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座各種反應(yīng)器的示意圖81酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶反應(yīng)器的類

28、型間歇式攪拌罐反應(yīng)器連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器填充床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器連續(xù)攪拌罐-超濾膜反應(yīng)器，連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器/連續(xù)攪拌罐循環(huán)式反應(yīng)器82酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座這類反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，造價(jià)較低，傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)能迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)，主要應(yīng)用在飲料和食品工業(yè)中。其缺點(diǎn)是操作麻煩，在反復(fù)回收過程中固定化酶容易損失，所以工業(yè)規(guī)模的固定化酶很少采用。常用于游離酶。間歇式攪拌罐反應(yīng)器間歇式攪拌罐反應(yīng)器83酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座這種反應(yīng)器在運(yùn)轉(zhuǎn)過程中，底物以恒定的流速流入反應(yīng)器，與此同時(shí)，反應(yīng)液則以同樣的流速流出反應(yīng)器。反應(yīng)桶內(nèi)裝有攪拌器，使反應(yīng)組分與固定化酶顆粒混合均一，出口處有過濾膜，可使不斷補(bǔ)充新鮮底物與反

29、應(yīng)液流量維持動態(tài)平衡。連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器84酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)液混合良好，各部位的成分相同，并與流出液的組成也一致。連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器的開放結(jié)構(gòu)使得調(diào)換固定化酶比較容易，而且有利于控制溫度和調(diào)節(jié)pH，還能夠處理膠態(tài)或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器有較高的轉(zhuǎn)化率。缺點(diǎn)：由攪拌產(chǎn)生的剪切力較大，易打碎磨損固定化酶顆粒。需改良的連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器。85酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器又稱固定床反應(yīng)器?？商畛涠嘞虍愋园胪感灾锌绽w維制成管狀，內(nèi)部填充酶膜、酶片等。在填充床反應(yīng)器內(nèi)，底物在一定方向上以恒定的速度通過固定化酶柱，

30、以近似活塞式流動反應(yīng)器（Plug Flow Reactor，PFR）運(yùn)轉(zhuǎn)。86酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器種裝有較小顆粒的垂直塔式反應(yīng)器。反應(yīng)時(shí)，底物溶液以足夠大的流速，從反應(yīng)器底部向上通過固定化酶柱床，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài)。其混合程度介于連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器的全混型和填充床的平推流型之間。由于反應(yīng)器內(nèi)混合程度高，因此，傳熱、傳質(zhì)情況良好，可處理粘性大、含有固體顆粒的底物。87酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座連續(xù)攪拌罐-超濾膜反應(yīng)器，連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器UF結(jié)構(gòu)是連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器與超濾裝置聯(lián)用的酶膜反應(yīng)器。在連續(xù)流動

31、攪拌罐反應(yīng)器出口處設(shè)置一個(gè)超濾裝置，通過超濾裝置，酶可以循環(huán)使用。該超濾器中的半透性超濾膜只允許小分子產(chǎn)物通過，不允許大分子酶和底物通過。該反應(yīng)器適用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。88酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座循環(huán)式反應(yīng)器外循環(huán)反應(yīng)器 內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器 循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸機(jī)會，以達(dá)到所需的轉(zhuǎn)化率。這種反應(yīng)器可用于難溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 89酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座酶反應(yīng)器的選擇依據(jù)根據(jù)固定化酶的形狀：溶液酶：間歇式攪拌罐反應(yīng)器顆粒狀和片狀：連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器膜狀和纖維狀：填充床反應(yīng)器容易變形、易粘結(jié)、顆粒細(xì)?。毫骰卜磻?yīng)器根據(jù)底物

32、的物理性質(zhì)溶解性和濁液性底物：任何類型顆粒狀和膠狀底物：連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、循環(huán)式反應(yīng)器90酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座二 酶固定化對其動力學(xué)特性的影響酶固定后，酶本身的結(jié)構(gòu)必然受到擾動，同時(shí)酶固定后，由于擴(kuò)散限制效應(yīng)、空間位阻作用以及載體性質(zhì)等因素必然對酶的性質(zhì)產(chǎn)生影響。91酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座、 固定化酶的活力酶活力表現(xiàn)率一般降低(Km )EnzymeAgent of immobiliztionsubstrateKm/(mol/L)Creatine kinaseFree EATP6.510-4Aminobenzoic celluloseATP8.010-4Lactate deh

33、ydrogenaseFree ENADH7.810-6Propionyl-glassNADH5.510-5chymotrypsinFree EATEE1.010-3Soluble-aldehyde glucoseATEE1.310-3Ficus proteinaseFree EBAEE2.010-2CMC-70BAEE2.010-2Trypase Free EBAA6.810-3Maleate/ethylideneBAA2.010-4Tab1 M-constant of free E and immobilized E92酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座、 固定化酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性普遍提高保存期t1/2

34、增1倍;熱穩(wěn)定性比溶液提高10倍以上(空間結(jié)構(gòu)堅(jiān)固，加熱不易變型)93酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座二、影響固定化酶動力學(xué)的因素1、空間效應(yīng)（包括構(gòu)象和屏蔽） 酶，三維空間結(jié)構(gòu)；固定化，由于E與載體的相互作用，引起酶活性部位發(fā)生扭曲變形，改變活性部三維結(jié)構(gòu)，減弱了結(jié)合力，稱構(gòu)象效應(yīng)。 載體的存在使酶分子不易與酶活性部位接觸，對酶活性部位造成空間障礙，使酶活下降，稱屏蔽效應(yīng)（位阻效應(yīng)）94酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座1、空間效應(yīng)（包括構(gòu)象和屏蔽）圖、固定化酶的結(jié)構(gòu)改變和屏蔽效應(yīng)95酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座2、分配效應(yīng)含固定化酶的多種載體示意圖幾個(gè)概念構(gòu)成多相體系；微環(huán)境（固酶附近）主體溶液分配效應(yīng)(SP濃度不同

35、的現(xiàn)象)96酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座3、擴(kuò)散效應(yīng)幾個(gè)概念酶固定酶濃度不均勻,S均勻S向活性擴(kuò)散,反應(yīng)后P向溶液擴(kuò)散 ；內(nèi)擴(kuò)散（固酶內(nèi)表面向微孔內(nèi)酶活性中心）外擴(kuò)散(溶液主體向固定化酶表面)反應(yīng)和擴(kuò)散的關(guān)系內(nèi)擴(kuò)散效應(yīng)和外擴(kuò)散效應(yīng)?97酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座固定化酶與液相反應(yīng)物系相接觸的反應(yīng)過程為:第一步：底物由液相主體擴(kuò)散到載體的外表面第二步：底物在載體的外表面進(jìn)行反應(yīng)第三步：產(chǎn)物由外表面擴(kuò)散到液相主體傳質(zhì)過程反應(yīng)過程98酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座第五節(jié) 固定化技術(shù)的應(yīng)用微主物細(xì)胞固定化后,受載體影響，只用于生產(chǎn)各種能夠分泌到胞外產(chǎn)物 。一、利用固定化微生物生產(chǎn)各種產(chǎn)物（1）酒精、酒類。生產(chǎn)酒精、啤酒

36、、葡萄酒。（2）氨基酸。谷氨酸、賴氨酸、精氨酸等。（3）有機(jī)酸。蘋果酸，檸檬酸葡萄糖酸衣康酸。（4）酶和輔酶。淀粉酶糖化酶；蛋白酶等。（5）抗生素。99酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座二、利用固定化微生物細(xì)胞(酶)制造生物傳感器生物傳感器是由固定化生物細(xì)胞或酶與各種能量轉(zhuǎn)換器，密切結(jié)合而成的傳感裝置通常由感受器；換能器和電子線路三部分組成。當(dāng)待測物質(zhì)通過傳感器時(shí)固定在感受器上親和配基與待測生物分子相互作用的瞬間發(fā)生能量的轉(zhuǎn)栘。經(jīng)過換能器，以電或光等物理訊號,方式輸出，經(jīng)過電子系統(tǒng)放大處理顯示,就可以測出物質(zhì)的量.100酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座生物傳感器的發(fā)展應(yīng)用生物傳感器的理論研究近幾年才取得突破性進(jìn)展產(chǎn)

37、生一些新的分析檢測裝置目前市售有:葡萄糖檢測儀，免疫分析檢測早孕；乙肝和尿糖試紙等。101酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座三、藥物控釋載體新的藥物不斷問世，但應(yīng)用于臨床卻不順利,其可能原因:（1）很多藥物尤其是蛋白類藥物，口服很容易被胃酸破壞或沉淀。（2）單純注射后瞬時(shí)血藥濃度升高，但馬上被肝臟及血液中的酶系統(tǒng)所清除。（3）蛋白質(zhì)類藥物容易引起免疫反應(yīng)。（4）很多藥物穩(wěn)定性差，不耐貯存。102酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座藥物的新劑型藥物的新劑型特點(diǎn)-合理給藥體系，即是從時(shí)間和空間分布上控制藥物的釋放。 藥物的新劑型包括：聚合的修飾、凝膠包埋、微球、脂質(zhì)體及免疫導(dǎo)向等；控釋體系將藥物與聚合物載體偶聯(lián)或固定于某種

38、聚合物載體上，稱為載體藥物。103酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座1聚合物修飾 多用于蛋白質(zhì)類藥物；這類藥物半衰期短,免疫原性強(qiáng),可用適當(dāng)水溶性高分子聚合物加以改善其性能。例如，用甲基殼聚糖對天冬酰胺酶的修飾及聚乙二醇對原核表達(dá)重組人血小板生成素分子的修飾等，均可起到降低毒性；延長半衰期的作用104酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座3 微球制劑 用高聚物微球包埋或比學(xué)偶聯(lián)藥物可制成微球制劑，它具有靶向性緩沖性及減少抗藥 性等特點(diǎn)；微球與靶細(xì)咆接觸，可以通過胞飲進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)生作用不影響細(xì)胞膜通透性.不會產(chǎn)生 產(chǎn)生抗藥性，早期使用的微球制劑不被生物降解，多為口服制劑106酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座4脂質(zhì)體脂質(zhì)體是磷脂雙分子層在水溶液中,自發(fā)形成超微中空小泡，它同微球制劑一樣都有靶向性；長效性并且可以通過胞飲作用向胞內(nèi)釋放藥物從而避免抗藥性.107酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座5導(dǎo)向藥物 導(dǎo)間藥物具有主動靶向性；將針對腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體與化療藥物交聯(lián)，直接作用于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，并且降低全身毒性但是抗體藥物復(fù)合物與腫瘤細(xì)胞結(jié)合數(shù)目有限，難于有效手傷腫瘤細(xì)胞。因而用毒性強(qiáng)烈的毒素取代化療藥物制備免疫毒素，具有更強(qiáng)烈的殺傷效果,免疫毒素還可用于骨髓移植中，供體骨髓中T細(xì)胞的選樣性殺傷以避免栘植物抗宿主病的發(fā)生.108酶工程醫(yī)學(xué)知識專題講座四、酶的結(jié)構(gòu)與