細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)課件

細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)沈怡彤王辰宋瑞鑫王賀申孫佳麗王君雅概況

從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長，稱之為組織培養(yǎng)。組織培養(yǎng)技術(shù)在流感病毒研究及監(jiān)測等方面的應(yīng)用已越來越引起人們的重視。因近來發(fā)現(xiàn)，用組織培養(yǎng)細(xì)胞所分離到的流感病毒，其抗原性和基因特性要比用雞胚分離到的更接近原始采集的標(biāo)本，故世界衛(wèi)生組織號召大家尋找合適的細(xì)胞來制備流感病毒疫苗，來替代雞胚制備疫苗。最近我國發(fā)現(xiàn)，“O”相流感病毒株在人群中消失30余年后，又重新出現(xiàn)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)用組織培養(yǎng)細(xì)胞來分離“O”相毒株要比雞胚系統(tǒng)敏感的多。

細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)

可提供大量生物性狀相同的細(xì)胞作為研究對象，比較經(jīng)濟(jì)，方便可消除其他外界因素的影響，對疫苗生產(chǎn)來說其抗原性更接近于自然流行株可減少宿主蛋白成分，減少變態(tài)反應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

接種細(xì)胞量培養(yǎng)液氫離子濃度及氣體條件溫度無菌條件和培養(yǎng)器皿的清潔度

細(xì)胞接種數(shù)

一般來講，細(xì)胞量越大繁殖的速度越快，但太大的細(xì)胞量對于生長亦不利。傳代細(xì)胞一般為10—30萬/ml，細(xì)胞一般可在3—7天長成單層

酸堿度

細(xì)胞生長最宜的PH范圍是7.0—7.4。細(xì)胞可忍受較大的范圍PH變化（PH6.6—7.8）培養(yǎng)環(huán)境偏酸較偏堿更宜于細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽、磷酸氫鹽和血清。其中碳酸氫鹽/CO2為主要的緩沖體系，如使用CO2孵箱，能提供穩(wěn)定的5%CO2，可自動調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝引起的PH改變。另外，在培養(yǎng)液中加入氫離子緩沖劑，如HEPES可使培養(yǎng)液有較強(qiáng)的緩沖能力。

溫度

細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度與細(xì)胞來源的動物體溫一致，溫度增加2—3℃對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，低溫對細(xì)胞影響較小培養(yǎng)器皿的處理

常用的主要器皿：玻璃、塑料

玻璃器皿一般須用清潔液浸泡，清水洗10次后再用蒸餾水洗2次，烤干備用

單細(xì)胞的制備

貼壁生長的傳代細(xì)胞使之分散成單細(xì)胞的方法有酶消化法螯和劑分散法

酶消化法

胰蛋白酶能消化細(xì)胞間的蛋白質(zhì)成分，組織塊受它作用后細(xì)胞變?yōu)閳A形，再用吸管機(jī)械吹打或電動攪拌細(xì)胞可分散胰蛋白酶用的濃度過大或時(shí)間過長對細(xì)胞均有損傷，影響細(xì)胞的生長。因此，不同組織來源、不同年齡的動物組織所用酶的濃度和時(shí)間可以不同。通常用0.25%-0.5%的酶。組織培養(yǎng)的步驟準(zhǔn)備細(xì)胞生長液清洗細(xì)胞消化細(xì)胞加入生長液，混勻，分裝細(xì)胞瓶分類動物細(xì)胞組織培養(yǎng)植物細(xì)胞組織培養(yǎng)培養(yǎng)條件(1)、無菌、無毒的環(huán)境（添加一定量的抗生素、定期更換培養(yǎng)液）(2)、培養(yǎng)基葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、動物血清等動物細(xì)胞生長特性細(xì)胞貼壁：

懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。要求：

培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。細(xì)胞的接觸抑制：

當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。過程動物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體）作為基因工程中的受體細(xì)胞培養(yǎng)的動物細(xì)胞可以用于檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性為治療和預(yù)防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù)植物組織培養(yǎng)植物的組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性這個(gè)理論，近幾十年來發(fā)展起來的一項(xiàng)無性繁殖的新技術(shù)。植物的組織培養(yǎng)廣義又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織。器官或細(xì)胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。過程1）準(zhǔn)備階段查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結(jié)合實(shí)際制訂出切實(shí)可行的培養(yǎng)方案。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案配制適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)消毒劑以及不同培養(yǎng)階段所需的培養(yǎng)基，并經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌后備用。（2）外植體選擇與消毒選擇合適的部位作為外植體，采回后經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，然后進(jìn)行消毒處理。將消毒后的外植體在無菌條件下切割成一定大小的小塊，或剝離出莖尖，挑出花藥，接種到初代培養(yǎng)基上。（3）初代培養(yǎng)接種后的材料置于培養(yǎng)室或光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使外植體中已分化的細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，或頂芽、腋芽直接萌發(fā)形成芽。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基分化成不同的器官原基或形成胚狀體，最后發(fā)育形成再生植株。應(yīng)用在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)