植物的組織培養(yǎng)菊花

一、配制培養(yǎng)基二、無菌操作三、無菌培養(yǎng)四、觀察記錄

※上交實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)間：第15周

實(shí)驗(yàn)安排本周六下午2：30；3：30。本周（第九周）（11.5－11.9）第11、12、13、14周每周進(jìn)行觀察（11.19－12.14）第一頁(yè)，共二十九頁(yè)。

（1）深刻理解植物組織培養(yǎng)的基本概念和理論依據(jù)。（2）訓(xùn)練利用實(shí)驗(yàn)室的條件來合理設(shè)計(jì)和完成實(shí)驗(yàn)的基本技能。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡诙?yè)，共二十九頁(yè)。

植物組織培養(yǎng)就是將植物離體的生活部分（如器官、組織、細(xì)胞甚至原生質(zhì)體等）通過無菌操作接種在適宜的培養(yǎng)基上，在人工控制的條件（如溫度、光照、濕度等）下進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。

理論依據(jù)：植物細(xì)胞的全能性。植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶著一套完整的基因組，并具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。實(shí)驗(yàn)原理第三頁(yè)，共二十九頁(yè)。完整植株脫分化再分化外植體愈傷組織芽、根實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的依據(jù)依據(jù)一分化第四頁(yè)，共二十九頁(yè)。植物組織培養(yǎng)的過程接種脫分化再分化愈傷組織外植體再分化沖洗表面消毒第五頁(yè)，共二十九頁(yè)。

培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)物質(zhì)的種類和濃度在脫分化和再分化中起重要作用，尤其是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素類的比例。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的依據(jù)依據(jù)二生長(zhǎng)素類/細(xì)胞分裂素類高誘導(dǎo)根的分化中愈傷組織生長(zhǎng)不分化低誘導(dǎo)芽的分化第六頁(yè)，共二十九頁(yè)。①M(fèi)S培養(yǎng)基的大量元素；②MS培養(yǎng)基的微量元素；③MS培養(yǎng)基的鐵鹽；④有機(jī)附加成分；⑤2,4-D、NAA、6-BA；⑥蔗糖、冷凝脂；⑦0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl。條件一：實(shí)驗(yàn)藥品實(shí)驗(yàn)條件第七頁(yè)，共二十九頁(yè)。條件二：實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

①燒杯、移液器、量筒、精密電子天平、三角瓶、pH試紙、封口膜等；②高壓滅菌鍋；③無菌操作間、超凈工作臺(tái)；④能夠控制光照和溫度條件的培養(yǎng)室。實(shí)驗(yàn)條件第八頁(yè)，共二十九頁(yè)。要求

1.以菊花無菌苗為材料進(jìn)行以下培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)。（1）誘導(dǎo)菊花無菌苗葉片形成愈傷組織（2）誘導(dǎo)菊花無菌苗莖段形成苗實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第九頁(yè)，共二十九頁(yè)。菊花無菌苗實(shí)驗(yàn)材料第十頁(yè)，共二十九頁(yè)。具體做法全班分成小組，根據(jù)設(shè)計(jì)要求結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理、設(shè)計(jì)依據(jù)及已提供的實(shí)驗(yàn)條件，在查閱資料的基礎(chǔ)上，合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（主要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)計(jì)）。設(shè)計(jì)出初步方案后，每組推選一名代表向全班匯報(bào)設(shè)計(jì)的原理、方案和預(yù)期的結(jié)果；再經(jīng)全班討論確定最后的設(shè)計(jì)方案。第十一頁(yè)，共二十九頁(yè)。

全班分成6個(gè)小組，按照要求經(jīng)查閱資料、代表匯報(bào)和全班討論，最后確定設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基如下（MS為基本培養(yǎng)基）：

1.誘導(dǎo)菊花無菌苗葉片形成愈傷組織（1）MS+6-BA1+NAA0（1組，7人）（2）MS+6-BA1+NAA2（2組，7人）（3）MS+6-BA1+NAA4（3組，7人）

2.誘導(dǎo)菊花無菌苗莖段形成芽（4）MS+6-BA0+NAA0.2（4組，7人）

（5）MS+6-BA0.2+NAA0.2（5組，7人）（6）MS+6-BA2+NAA0.2（6組，7人）

根據(jù)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，利用提供的實(shí)驗(yàn)條件，我們將按照下列步驟完成實(shí)驗(yàn)。第十二頁(yè)，共二十九頁(yè)。

一、配制培養(yǎng)基二、無菌操作三、無菌培養(yǎng)四、觀察記錄實(shí)驗(yàn)步驟第十三頁(yè)，共二十九頁(yè)。一、配制培養(yǎng)基

1.配制母液實(shí)驗(yàn)步驟①M(fèi)S培養(yǎng)基的大量元素母液（20×）；②MS培養(yǎng)基的微量元素母液（100×）；③有機(jī)附加成分母液（100×）；④肌醇母液（100×）；⑤MS培養(yǎng)基的鐵鹽母液（200×）；⑥6-BA、2,4-D、NAA母液(0.5mg/mL)。第十四頁(yè)，共二十九頁(yè)。2.配制培養(yǎng)基

各個(gè)小組根據(jù)自己的設(shè)計(jì)方案進(jìn)行。

要求：每一種培養(yǎng)基400mL，分裝10瓶，每瓶40mL，每瓶做好標(biāo)記，如：1，2，……。（1）加溶液。順序?yàn)椋捍罅吭亍⒘吭亍郊映煞帧〈肌F鹽→植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑→蔗糖→冷凝脂（2）攪拌混勻;

（3）定容至400mL；（4）調(diào)pH值至5.8~6.2；（5）分裝、封口。

3.培養(yǎng)基滅菌高壓滅菌(壓力1.1kg/cm2,

121℃,20min

)。濕熱滅菌第十五頁(yè)，共二十九頁(yè)。各物質(zhì)加入量：

400mL①大量元素母液（10×）100mL/L--40mL;

②微量元素母液（100×）10mL/L--4mL；③有機(jī)附加成分母液（100×）10mL/L--4mL

；④蔗糖(30g/L)、冷凝脂(6g/L)12g、2.4g;⑤肌醇母液（100×）10mL/L--4mL；⑥鐵鹽母液（200×）5mL/L--2mL；⑦6-BA、2,4-D、NAA母液(0.5mg/mL)第十六頁(yè)，共二十九頁(yè)。編號(hào)培養(yǎng)基組成（mg/L）各物質(zhì)加入量（mL/400mL）6-BANAA1MS+6-BA1+NAA00.802MS+6-BA1+NAA20.81.63MS+6-BA1+NAA40.83.24MS+6-BA0+NAA0.200.165MS+6-BA0.2+NAA0.20.160.166MS+6-BA2+NAA0.21.60.16表培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑加入量第十七頁(yè)，共二十九頁(yè)。第十八頁(yè)，共二十九頁(yè)。二、無菌操作

1.接種前的準(zhǔn)備（1）空間滅菌(30min)。無菌操作間和超凈工作臺(tái)。開紫外燈→開鼓風(fēng)機(jī)→關(guān)紫外燈→10min后→開日光燈。（2）操作人員的準(zhǔn)備剪指甲→用肥皂徹底洗手3~5次→自然風(fēng)干→進(jìn)操作間→用70~75%酒精反復(fù)檫手(圖)。（3）器具滅菌實(shí)驗(yàn)器械的消毒滅菌（圖）。第十九頁(yè)，共二十九頁(yè)。2.接種（1）切取材料左手持鑷，右手持刀→切取材料→葉片：0.5cm×0.5cm，莖段帶一個(gè)腋芽。第二十頁(yè)，共二十九頁(yè)。

（2）接種取三角瓶→打開封口膜→接種葉塊：正接，每瓶3塊莖段：形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基，每瓶3個(gè)

（3）重新封口（4）做標(biāo)記班級(jí)，日期第二十一頁(yè)，共二十九頁(yè)。三、無菌培養(yǎng)將接種好的三角瓶置于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光/暗=14h/10h；

T=25℃；

RH(relativehumitidy)=70~80%四、觀察記錄

第二十二頁(yè)，共二十九頁(yè)。

在培養(yǎng)過程中，每周定時(shí)觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果1次。內(nèi)容：（1）污染率污染率(%)=(污染的瓶數(shù)/接種瓶數(shù))×100%

（2）愈傷組織形成的時(shí)間、部位、顏色、大小、形狀，計(jì)算出愈率。出愈率(%)=(產(chǎn)生愈傷組織的葉塊數(shù)/接種的葉塊數(shù))×100%

（3）芽形成的時(shí)間、芽數(shù)、葉數(shù)、叢生芽數(shù)，計(jì)算出芽率。出芽率(%)=(出芽的莖段數(shù)/接種的莖段數(shù))×100%第二十三頁(yè)，共二十九頁(yè)。（1）比較不同的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織形成的影響；（2）比較不同的培養(yǎng)基對(duì)芽形成的影響。結(jié)果分析與討論第二十四頁(yè)，共二十九頁(yè)?！阏J(rèn)為組織培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵因素有哪些？思考題第二十五頁(yè)，共二十九頁(yè)。

本次實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6周，在此過程中大家經(jīng)歷了大量查閱資料，精心設(shè)計(jì)方案，認(rèn)真動(dòng)手操作，仔細(xì)觀察記錄，全面總結(jié)分析等各個(gè)環(huán)節(jié)。通過該過程，培養(yǎng)了科學(xué)態(tài)度和團(tuán)隊(duì)合作精神，提高了設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)際動(dòng)手操作和分析解決問題的能力。因此，本實(shí)驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期的目的?？偨Y(jié)第二十六頁(yè)，共二十九頁(yè)。序號(hào)培養(yǎng)基接種數(shù)/個(gè)污染率/%愈傷組織誘導(dǎo)率/%苗誘導(dǎo)率/%愈傷組織或苗的生長(zhǎng)情況123456

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)菊花愈傷組織及苗誘導(dǎo)的影響（d）第二十七頁(yè)，共二十九頁(yè)。第二十八頁(yè)，共二十九頁(yè)。內(nèi)容總結(jié)