《實(shí)驗(yàn).溶液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（選做）》 教學(xué)課件

測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法較多基本上都是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性建立起來的。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法:定氮法,雙縮脲法(Biuret法)Folin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法.另外還有一種近十年才普遍使用起來的新測(cè)定方法,考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法).其中Bradford法和Lowry法靈敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比Biuret法高100倍以上.凱氏定氮法比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。一、凱氏定氮法：根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量來測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。公式:每g樣品中含氮克數(shù)

×6.25×100二、比色法：利用蛋白質(zhì)與不同試劑的呈色反應(yīng)，測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，如雙縮尿法和酚試劑法（lowry’smethod）。三、紫外分光光度法：利用蛋白質(zhì)對(duì)280nm紫外光有最大的吸光度而采用。蛋白質(zhì)呈色試劑:酚試劑磷鉬酸--鎢酸的混和酸半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸組氨酸還原型混和酸

(蘭色)蛋白質(zhì)肽鍵堿性烯醇化銅離子在pH10條件下螯合在肽鍵結(jié)構(gòu)中從而使電子轉(zhuǎn)移到混和酸的顯色劑上，增強(qiáng)了酚試劑對(duì)蛋白質(zhì)的敏感性。微量凱氏定氮法

樣品與濃硫酸共熱,含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨,氨又與硫酸作用變成硫氨.經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨,借蒸汽將氨蒸至酸液中,根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品氮的含量.以甘氨酸為例:H2NCH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3(l)(1)2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3(3)此法靈敏度低,適用于0.2-1.0mg氮,誤差為2%,費(fèi)時(shí)8-10小時(shí),將氮轉(zhuǎn)化為氨,用酸吸收后滴定。優(yōu)點(diǎn)凱氏定氮法由于具有測(cè)定準(zhǔn)確度高，可測(cè)定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點(diǎn)，因而被公認(rèn)為是測(cè)定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。1.酒精燈2.蒸汽發(fā)生器3.長玻璃管4.橡皮管5.小玻杯6.棒狀玻璃塞7.反應(yīng)室8.反應(yīng)室外殼9.夾子10.反應(yīng)室中插管11.冷凝管12.錐形瓶13.石棉網(wǎng)比色法一.概述

比色法:在分析化學(xué)中,利用比較有色溶液顏色的深淺來測(cè)定物質(zhì)含量的分析方法稱為比色法。過去大多用眼睛觀察比較,故又稱目視比色法。

光電比色法(分光光度法):

隨著近代分析儀器的發(fā)展,目前已普遍使用光電比色計(jì)(分光光度計(jì))通過測(cè)量有色溶液對(duì)入色光的吸收程度對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分析,稱為光電比色法(分光光度法)。與目視比色法相比,光度法的特點(diǎn):①靈敏度高;10-5_10-6mol/L②準(zhǔn)確度較高;③儀器設(shè)備較簡單,操作簡便、快速；④應(yīng)用廣泛。二、朗伯-比爾定律

物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí),起其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度b成正比。

透光度(透光率T):吸光度(A):朗伯-比爾定律:

標(biāo)準(zhǔn)曲線:

根據(jù)朗伯-比爾定律,當(dāng)吸收池厚度不變,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)作圖時(shí),應(yīng)得到一條通過原點(diǎn)的直線,稱為校正曲線或標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.標(biāo)準(zhǔn)曲線2.正偏離3.負(fù)偏離分光光度計(jì)分光光度計(jì)的基本依據(jù)是朗伯—比耳定律，它是根據(jù)相對(duì)測(cè)量原理工作的，即先選定某一溶劑作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)定其透光率為100%，被測(cè)試樣的透光率是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)溶液而言的，即讓單色光分別通過被測(cè)試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液，二者能量的比值就是在一定波長下對(duì)于被測(cè)試樣的透光率。如圖所示，白色光源經(jīng)入射狹縫、反射鏡和透光鏡后，變成平行光進(jìn)入棱鏡，色散后的單色光經(jīng)鍍鋁的反射鏡反射后，再經(jīng)過透鏡并聚光于出射狹縫上，狹縫寬度為0.32nm。反射鏡和棱鏡組裝在一可旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上并由波長調(diào)節(jié)器的凸輪所帶動(dòng)，轉(zhuǎn)動(dòng)波長調(diào)節(jié)器便可以在出光狹縫后面選擇到任一波長的單色光。單色光透過樣品吸收池后由一光量調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)為適度的光通量，最后被光電電池吸收，轉(zhuǎn)換成電流后由微電計(jì)指示，從刻度標(biāo)尺上直接讀出透光率的值。7200型分光光度計(jì)722-2000型分光光度計(jì)UV-2000型紫外分光光度計(jì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定——雙縮脲法蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)），且其呈色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。但必須注意，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有H2N—CH＝NH-CH2-NH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽性。靈敏度低，所能測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度范圍僅僅為1-10mg/L，因此沒次實(shí)驗(yàn)所需的樣品量都比較大。主要試劑雙縮脲試劑：溶解1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）于500ml水中，在攪拌下加入300ml

10%氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1升，貯存在內(nèi)壁涂以石臘的瓶中。此試劑可長期保存，以備使用。Folin-酚法（lowry法）在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的Tyr和Phe殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。在540nm處測(cè)定樣品吸光值，確定其蛋白質(zhì)含量主要試劑Folin—酚試劑甲（用前組分一:組分二=50:1）（1）1克Na2CO3和0.2克NaOH溶解于50毫升蒸餾水中。（2）0.5克硫酸銅（CuSO4?5H2O）溶解100毫升1%酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6?4H2O）中。

每次使用前，將50ml（1）與1ml（2）混合，即為試劑甲。Folin—酚試劑乙（用前稀釋一倍） 在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO4?2H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的設(shè)備。靈敏度比較高，比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5-100μg蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：Folin-酚試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中的酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法受蛋白質(zhì)特異性影響，蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸含量不同使得顯色強(qiáng)度也不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線。此方法的初步顯色是雙縮脲反應(yīng)，因此，凡是干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)（因素）都會(huì)干擾Folin-酚反應(yīng)。紫外吸收法

蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系符合朗伯-比耳定律，因此，可用比色法直接測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。優(yōu)點(diǎn)：1.快速；2.對(duì)蛋白質(zhì)無破壞性。缺點(diǎn)：1.不是嚴(yán)格的定量方法。因?yàn)榇朔ㄊ歉鶕?jù)酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）殘基的強(qiáng)吸收值來測(cè)定的，不同的蛋白質(zhì)具有不同的消光系數(shù)。另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中不含Tyr、Phe或Trp殘基時(shí)，該方法就不能檢出蛋白。（此法用于測(cè)粗提總蛋白濃度較為適宜）

2.核酸可引起強(qiáng)烈干擾。

考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，有多種蛋白質(zhì)定量方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250法是比色法與色素法相結(jié)合的復(fù)合方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈棕紅色，在465nm下有最大吸收峰；當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈青藍(lán)色。在一定范圍內(nèi)，也就是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量在0~1000μg范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，所以可用比色法測(cè)定?？捡R斯亮藍(lán)G-250法有常量法和微量法兩種。Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：

（1）靈敏度高：蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度較高，最低檢出量為1ug蛋白質(zhì)。據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，（2）測(cè)定快速、簡便：染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，大約只需2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。

（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是：

（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用γ—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH，少量的去污劑可通過用適當(dāng)?shù)膶?duì)照消除，而必要時(shí)必須預(yù)先處理樣品。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。儀器和試劑1．儀器：分析天平；吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1；試管10個(gè)；722型分光光度計(jì)；容量瓶100ml、1000ml各一個(gè)；2．試劑：（1）0.9%NaCl溶液；（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100ml，制成0.1mg/ml的原液。（3）考馬斯亮藍(lán)G-250（0.01%）染液：稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液不宜久存，在常溫中可放置1-2個(gè)月。（4）樣品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml的溶液，用0.9%NaCl溶液稀釋至一定濃度。操作步驟1．0~100μg／mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取8支具塞試管，編號(hào)后，按下表加入試劑，蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混勻，室溫靜置5min后，以管1為空白對(duì)照，在595nm下比色測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。管號(hào)12345678蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.10.20.30.40.60.81.00.9%NaCl溶液（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考馬斯亮藍(lán)染液55555555蛋白質(zhì)含量（μg）0102030406080100A5952．樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定另取兩支干凈的試管（做一重復(fù)），加入合適濃度的待測(cè)樣品，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，測(cè)定方法同上，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量。計(jì)算

樣品的蛋白質(zhì)含量（μg/g鮮重）=[查得的蛋白質(zhì)含量（μg）/[樣品鮮重（g）]注意事項(xiàng)1.如果要求嚴(yán)格，最好在試劑加入后的5~20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)檫@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。2．測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上