蔗糖酶的提取及離子交換柱層析分離純化蔗糖酶 實(shí)驗(yàn)報(bào)告

專業(yè)：生物科學(xué)姓名：專業(yè)：生物科學(xué)姓名：學(xué)號(hào)：日期：地點(diǎn)：裝訂線課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲）指導(dǎo)老師：成績(jī)：__________________實(shí)驗(yàn)名稱：蔗糖酶的提取及離子交換柱層析分離純化蔗糖酶實(shí)驗(yàn)類型：生化實(shí)驗(yàn)同組學(xué)生姓名：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填） 五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理 七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)掌握蔗糖酶的提取、分離純化的基本原理和方法。2、學(xué)習(xí)離子交換層析的基本原理；3、學(xué)習(xí)離子交換層析分離蛋白質(zhì)的基本方法和技術(shù)；4、學(xué)習(xí)蔗糖酶活性檢測(cè)的基本原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理1、酵母細(xì)胞破碎本實(shí)驗(yàn)采用研磨的方法。通過(guò)固體剪切法（研磨）將酵母細(xì)胞破碎，把蔗糖酶從酵母細(xì)胞中提取出來(lái)。2、蔗糖酶的初步分離純化蛋白酶常用的初步分離純化方法有：鹽析、選擇性變性、有機(jī)溶劑沉淀等。本實(shí)驗(yàn)采用選擇性變性（加熱）、有機(jī)溶劑（乙醇）沉淀等方法對(duì)蔗糖酶進(jìn)行初步的提純。由于酶蛋白在分離純化過(guò)程中易變性失活，為了能獲得盡可能高的產(chǎn)率和純度，在提純操作中要始終保持酶的活性，如在低溫下操作等，這樣才能收到較好地分離提純效果。3、離子交換層析離子交換層析是常用的層析方法之一。它是以離子交換劑為固定相，根據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換劑與流動(dòng)相中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白質(zhì)所帶的電荷存在差異，因而與離子交換劑的親和力就有區(qū)別。當(dāng)洗脫液的pH改變或者鹽的離子強(qiáng)度逐漸提高時(shí)，使某一種蛋白質(zhì)的電荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，不同的蛋白質(zhì)按所帶電荷的強(qiáng)弱逐一被洗脫下來(lái)，達(dá)到分離的目的。4、酶活力檢測(cè)(定性檢測(cè)）蔗糖酶是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2－糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖。還原糖的測(cè)定有多種方法，如采用3.5－二硝基水楊酸法，其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。本實(shí)驗(yàn)在離子交換層析分離純化的過(guò)程中，對(duì)分離純化樣品采用3.5－二硝基水楊酸法來(lái)初步判定樣品中還原糖含量的多少，由此來(lái)確定并收集蔗糖酶純化樣品。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料市售干酵母粉10g/組，蔗糖酶粗分離純化樣品Ⅲ2、實(shí)驗(yàn)試劑1、石英砂；2、95%乙醇(-20℃）；3、DEAE-SepharoseFastFlow(弱堿性陰離子交換劑)；4、20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液；5、20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3緩沖液；6、0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5；7、5%蔗糖溶液；8、3，5-二硝基水楊酸試劑四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、電子天平（稱量樣品）；2、研砵（每組一套）；3、50ml高速離心管（4支/組、4孔50ml離心管架一個(gè)/組）；4、托盤(pán)天平（離心管平衡用）；5、高速冷凍離心機(jī)；6、恒溫水浴箱；7、制冰機(jī)；8、1.5ml離心管；9、－20℃冰箱；10、層析柱（φ1.0×20㎝）(1支/組）；11、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1臺(tái)/組）；12、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/組）；13、核酸蛋白檢測(cè)儀（靈敏度0.5A）（1臺(tái)/組）；14、記錄儀（紙速：0.5mm/min；靈敏度：50mV）（1臺(tái)/組）；15、部分收集器及收集試管（1臺(tái)/組）；16、鐵架臺(tái)、夾子（固定層析柱用）（1套/組）；17、－20℃冰箱；18、試管、試管架等。五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟1、酵母細(xì)胞破碎稱取市售干酵母粉10g，約3-5g石英砂放入研缽中直接干燥充分研磨至盡可能成細(xì)粉末狀（約15分鐘），量取總體積30-40ml的20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液，分2次加在研砵內(nèi)研磨10分鐘，使呈糊狀液體（研磨越徹底，釋放出的蔗糖酶越多）；將糊狀液體轉(zhuǎn)移到2支50ml離心管中，兩支離心管平衡后，4℃、12000r/min離心15分鐘（這次離心分離掉酵母碎片和酵母），收集上清液并量出體積V1（樣品I）,另留1ml上清液（樣品I）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力測(cè)定和SDS分析。2、熱處理：將上一步抽提液（樣品I），迅速放入50℃恒溫水浴中，保溫30分鐘，并用玻璃棒溫和攪拌抽提液（由于蔗糖酶相對(duì)耐熱，熱處理能除去很多不耐熱的雜蛋白），保溫后迅速用冰浴冷卻5分鐘，轉(zhuǎn)移至兩支50ml離心管中，平衡后，4℃，15000r/min離心15分鐘（由于離心過(guò)程會(huì)產(chǎn)生熱量，故保持4℃一方面保證樣品不被破壞，另一方面保護(hù)離心機(jī)不因過(guò)熱而損壞），收集上清液并量出上清液體積V2（樣品Ⅱ），另留1ml上清液（樣品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、測(cè)定蔗糖酶活力和SDS分析。3、有機(jī)溶劑（乙醇）沉淀：將熱處理后的上清液逐滴加入相同體積的－20℃的95%乙醇（酒精除去水膜令蛋白沉淀，但由于乙醇會(huì)使蛋白局部變形且在4℃以上時(shí)可使大部分蛋白完全變性，故保持4℃以下減少變性造成的損失），冰浴中溫和攪動(dòng)混勻，至少放置20分鐘，然后轉(zhuǎn)移至兩支50ml離心管中，兩支離心管平衡后，4℃，12000r/min離心10分鐘，棄去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存。4、離子交換劑準(zhǔn)備：(實(shí)驗(yàn)室已準(zhǔn)備好）5、樣品處理：將乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白樣品充分溶解于15ml20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液；4℃15000r/min,離心10分鐘，收集樣品上清液（樣品Ⅲ）測(cè)量總體積(ml數(shù)），取4ml進(jìn)行分離，其余置于5ml離心管中并放入－20℃冰箱。6、純化檢測(cè)儀器連接：將梯度混合器(100ml梯度杯)，層析柱（φ1.0×20㎝），恒流泵(10rpm)（流速0.8～1ml/min），核酸蛋白檢測(cè)儀（靈敏度0.5A），記錄儀（紙速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5ml/管/5min）等連接并設(shè)置好。7、裝柱(層析柱規(guī)格1×20cm)、平衡：裝柱前先調(diào)好流速5ml/10min，然后將柱下端的出水口關(guān)閉，加進(jìn)5ml（約1/3柱床體積）20mmol/LTris-HCl、pH7.3的緩沖液，然后將處理好的DEAE—SepharoseFastFlow，輕輕攪勻（注意不能太稀，也不能太稠，剛好呈流質(zhì)狀態(tài)）沿玻棒靠近柱管壁慢慢連續(xù)加進(jìn)柱內(nèi)至層析柱上端。注意不能帶進(jìn)氣泡，待凝膠自然沉積離柱管上端約1-2cm后松開(kāi)層析柱出口，控制流速5ml/10min；待柱內(nèi)DEAE—SepharoseFastFlow凝膠沉降至穩(wěn)定高度并分出水層后，吸去水層，用玻棒將沉降界面攪勻，再補(bǔ)加處理好的DEAE—SepharoseFastFlow凝膠，直到凝膠沉降至穩(wěn)定高度距層析柱上端約3cm處為止（這時(shí)須保持DEAE—SepharoseFastFlow凝膠柱面平整）。用20mmol/LTris-HCl、pH7.3的緩沖液連通層析柱，進(jìn)行柱平衡，直到流出液與緩沖液的pH一致。8、加樣：停止加入20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液。待緩沖液液面與膠體表面相切時(shí)，恒流泵停止工作。用膠頭滴管緩慢將蔗糖酶蛋白樣品溶液（樣品Ⅲ）加入層析柱中，注意順著柱壁滴加，盡可能保持膠面平整。打開(kāi)恒流泵，使樣品溶液進(jìn)入膠體，待樣品溶液完全進(jìn)入膠體后，用少量洗脫緩沖液將殘余在層析柱壁上端的樣品洗下，并完全進(jìn)入膠體后，再加洗脫緩沖液至一定高度。9、洗脫：梯度洗脫法：加樣后，用20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液進(jìn)行平衡，洗脫流速為5ml/10min，洗去未被DEAE—SepharoseFastFlow凝膠吸附的雜蛋白，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測(cè)儀上繪出的基線穩(wěn)定，用20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液NaCl梯度洗脫（濃度為0-1mol/LNaCl），層析柱聯(lián)上梯度混合器，混合器中分別為50ml0.05mol/LTris-HClpH7.3緩沖液和50ml含1mol/LNaCl的0.05ml/LTris-HClpH7.3緩沖液。洗脫流速為5ml/10min，每5ml接一管，洗脫至緩沖溶液流完為止。將蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，測(cè)量總體積（ml數(shù)）（樣品Ⅳ），樣品－20℃低溫保存?zhèn)溆谩?0、蔗糖酶活力檢測(cè)：收集活力高的蔗糖酶液，測(cè)總體積(ml數(shù))（樣品Ⅳ），-20℃保存空白對(duì)照樣品管0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.51.5ml1.4ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml蒸餾水1.0ml0.9ml分離純化樣品溶液/0.1ml50℃水浴8min3.5－二硝基水楊酸試劑1.0ml1.0ml100℃水浴5min觀察顏色六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1.、V1=22.5ml，V2=18.5ml，V3=6.5ml，2、核酸蛋白檢測(cè)儀波形圖其中，從左至右第一個(gè)峰并未檢測(cè)出蔗糖酶，第二個(gè)大峰所在處收集的溶液檢測(cè)出蔗糖酶，故收集第二個(gè)大峰對(duì)應(yīng)的試管里面